羅紅霉素生產(chǎn)工藝分析摘要：目的：建立羅紅霉素干混懸劑微生物限度檢查法與驗(yàn)證。方法：薄膜過濾法，用含5%乙醇的0.1%蛋白胨溶液500ml分5次沖洗濾膜。結(jié)果各控制菌回收率均在70%以上。結(jié)論：該方法可行。關(guān)鍵詞：羅紅霉素生產(chǎn)工藝羅紅霉素干混懸劑為半合成的14元環(huán)大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，適用于化膿性鏈球菌引起的咽炎及扁桃體炎，敏感菌所致的鼻竇炙、中耳炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作，肺炎支原體或肺炎衣原體所致的肺炎，沙眼衣原體引起的尿道炎和宮頸炎，敏感細(xì)菌引起的皮膚軟組織感染。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜過濾法，用含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗濾膜，對(duì)該品種進(jìn)行微生物限度檢查，各控制菌回收率在70%以上，表明該方法可行。一、儀器與試藥1.儀器：HTY-2000集菌儀、集菌培養(yǎng)器（孔徑為0.45μm），HH.BII.420電熱恒溫培養(yǎng)箱、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、SartoriusBS2002S電子天平、SA-1480-Ⅱ凈化工作臺(tái)。2.培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基，均購于中檢所。3.菌種：枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC（F）98001、黑曲霉CMCC（F）98003（以上菌株均為第三代），均購于中檢所。4.菌液制備取經(jīng)30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1ml，加0.9%無菌氯化鈉至每ml含菌50～100cfu。1.4.2取經(jīng)23℃～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)的白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)液1ml，加0.9%無菌氯化鈉至每ml含菌50～100cfu。取經(jīng)23℃～28℃？培養(yǎng)5～7天的黑曲霉改良馬丁營養(yǎng)瓊脂斜面，用0.9%無菌氯化鈉3～5ml將孢子洗脫，加0.9%無菌氯化鈉至每ml含菌50～100cfu二、實(shí)驗(yàn)方法1.細(xì)菌霉菌及酵母菌檢查方法的驗(yàn)證供試液的制備取供試品10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100g，作為1：10的供試液。2.方法驗(yàn)證過程驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌的回收率。3.實(shí)驗(yàn)組取1：10供試液1ml，加入50ml含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液中，搖勻，立刻過濾，濾膜用500ml含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗后，用注射器加入菌液1ml，濾干，取濾膜培養(yǎng)。每株菌株（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）各做1份試驗(yàn)。4.菌液組取菌液1ml加入平皿中，立刻加入相應(yīng)的瓊脂，各菌株做2份平行試驗(yàn)。5.供試品對(duì)照組按試驗(yàn)組的方法不加菌液，測(cè)定供試品的本底菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組取上述菌液（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉）各1ml，加入50ml含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液中，濾過，濾膜用500ml含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液分5次沖洗后，濾干。取濾膜培養(yǎng)。每株菌株（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）各做1份試驗(yàn)。5.計(jì)算公式實(shí)驗(yàn)組的菌回收率=（實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)―供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組的平均菌落數(shù)稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)6.評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌回收率試驗(yàn)采用先制成1：10供試液，再用薄膜過濾法檢查，試驗(yàn)組的回收在70%以上，表明可用上述方法檢查細(xì)菌、霉菌及酵母菌。7.結(jié)果經(jīng)過培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，控制菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌以及黑曲霉）的回收率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，實(shí)驗(yàn)組各控制菌的的回收率均高于70%，稀釋既對(duì)照組的回收率也高于70%，說明用含5%乙醇的0.1%蛋白胨溶液500ml分5次沖洗濾膜的這種方法可行。8.試驗(yàn)組取1：10供試液10ml，加入500ml含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液中，搖勻，立刻過濾，濾膜用500ml含5%乙醇的0.1%無菌蛋白胨溶液分5次沖洗后，用注射器加入大腸埃希菌菌液1ml，濾干，取濾膜加至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h。取培養(yǎng)物0.2ml，接種于5mlMUG培養(yǎng)基中，35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5/24h。9.評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組應(yīng)顯大腸埃希菌的特征，陰性對(duì)照組不得顯大腸埃希菌的特征。10.結(jié)果試驗(yàn)組366nm紫外燈下觀察呈現(xiàn)熒光，源管壁加入靛基質(zhì)，液面呈玫瑰紅色，顯大腸埃希菌的特征反應(yīng)，陰性對(duì)照組無上述現(xiàn)象，不顯大腸埃希菌的特征反應(yīng)，表明上述方法檢驗(yàn)羅紅霉素干混懸劑方法可行。討論常規(guī)法與薄膜過濾法的比較常規(guī)法：取1：10供試液1ml，分別加入5株代表試驗(yàn)菌50～100cfu，立即傾注15～20ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，待凝固置于規(guī)定溫度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72h，觀察結(jié)果，計(jì)算菌落數(shù)作為試驗(yàn)組，同法測(cè)定相應(yīng)加入的實(shí)驗(yàn)均數(shù)作為菌液組、測(cè)定供試品本底菌數(shù)作為供試品對(duì)照組，按公式計(jì)算回收率均為0。因?yàn)榱_紅霉素干混懸劑為抗生素制劑，有很強(qiáng)的抑菌作用，因此在用常規(guī)法測(cè)定控制菌的回收率時(shí)，羅紅霉素的抑菌能力會(huì)抑制控制菌的生長(zhǎng)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)定，所以驗(yàn)證時(shí)不考慮常規(guī)法，而是采用薄膜過濾法。原因分析羅紅霉素在乙醇或丙酮中易溶，在甲醇中溶解，在乙腈中溶解，在水中幾乎不溶。用《中國藥典》2010版二部規(guī)定的兩種沖洗劑，無法除去羅紅霉素的干擾，甲醇，乙腈，丙酮有一定的毒性，也不考慮使用，考慮選用乙醇溶解羅紅霉素，當(dāng)用含有乙醇的無菌蛋白胨緩沖液沖洗供試品時(shí)，乙醇能夠增大羅紅霉素在緩沖液中的溶解度，可以溶解供試品中的羅紅霉素，從而可以排除羅紅霉素對(duì)控制菌回收率的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具說服力。通過三次實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證可以降低每次實(shí)驗(yàn)過程帶來的誤差（如人為因素、環(huán)境因素、溫濕度影響等），更能體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出，用5%乙醇的無菌蛋白胨緩沖液來沖洗濾膜來驗(yàn)證各個(gè)控制菌的回收率的方法可行的。四、結(jié)論在羅紅霉素干混懸劑的薄膜過濾法中，用不含乙醇的無菌蛋白胨緩沖液來沖洗供試品是不可取的，本研究的目的是驗(yàn)證用含5%乙醇的無菌蛋白胨緩沖液來沖洗濾膜來計(jì)算各個(gè)控制菌回收率的高低的方法是否