《生物制藥學(xué)》考試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共20分）1.下列哪一項不是單克隆抗體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）？A.糖基化位點占有率B.電荷異構(gòu)體比例C.宿主細(xì)胞蛋白殘留量D.原料藥溶解度答案：D解析：溶解度屬于制劑開發(fā)階段關(guān)注的物理性質(zhì)，而非抗體分子本身的CQA；其余三項均直接影響藥效、免疫原性或藥代動力學(xué)。2.在CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)中，若乳酸脫氫酶（LDH）活性突然升高，最可能的原因是：A.培養(yǎng)液滲透壓過低B.溶氧（DO）設(shè)定點上調(diào)C.細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡或裂解D.葡萄糖濃度升高答案：C解析：LDH為胞內(nèi)酶，培養(yǎng)液中活性驟增提示細(xì)胞膜完整性破壞，常與凋亡晚期或機械破損相關(guān)。3.依據(jù)ICHQ5E，對生物制品變更進行可比性研究時，若“質(zhì)量可比”已證實，則下一步：A.可直接豁免臨床B.必須開展III期驗證C.需評估藥代/藥效橋接數(shù)據(jù)D.僅需上報藥監(jiān)備案答案：C解析：質(zhì)量可比是前提，但仍需PK/PD橋接以確認(rèn)臨床性能無負(fù)面變化；是否豁免進一步臨床由監(jiān)管機構(gòu)綜合評定。4.某Fc融合蛋白的Tm（unfoldingtemperature）由DSC測定為58℃，若處方中加入0.5%(w/v)精氨酸鹽酸鹽，其Tm可能：A.升高2–3℃B.降低2–3℃C.升高>5℃D.基本不變答案：B解析：精氨酸屬溫和變性劑，可部分去穩(wěn)定蛋白高級結(jié)構(gòu)，使Tm略降；但可抑制聚集，提高膠體穩(wěn)定性。5.對E.coli表達(dá)系統(tǒng)而言，下列哪種策略最能降低內(nèi)毒素水平？A.誘導(dǎo)溫度提高至42℃B.采用T7溶菌酶缺陷菌株C.在裂解液中加入0.2%TritonX-114并進行相分離D.更換為低拷貝質(zhì)粒答案：C解析：TritonX-114在低溫溶解、37℃形成膠束相，可萃取脂多糖（LPS），是實驗室與生產(chǎn)階段常用內(nèi)毒素去除手段。6.關(guān)于病毒清除驗證，下列說法正確的是：A.僅需要對終產(chǎn)品進行病毒檢測即可B.指示病毒必須包含人源嗜性病毒C.縮小模型（scaled-down）需保持與商業(yè)化工藝等同的LRVD.低pH孵育法對非包膜病毒同樣高效答案：C解析：縮小模型須驗證與商業(yè)規(guī)模對數(shù)減少值（LRV）相當(dāng)；低pH主要對包膜病毒有效；指示病毒可不為人源。7.某雙特異性抗體采用“杵-臼”（Knobs-into-Holes）結(jié)構(gòu)設(shè)計，其中Hole突變位于：A.CH3結(jié)構(gòu)域的一條重鏈B.CH2結(jié)構(gòu)域C.輕鏈恒定區(qū)D.F(ab’)2鉸鏈區(qū)答案：A解析：KiH技術(shù)通過CH3域大側(cè)鏈（Knob）與小側(cè)鏈（Hole）互補促進異源二聚，Hole突變引入一條重鏈CH3。8.在生物反應(yīng)器放大中，保持P/V（單位體積功率）不變主要為了：A.維持kLa（體積氧傳質(zhì)系數(shù)）相似B.維持剪切率一致C.維持混合時間一致D.維持二氧化碳去除速率一致答案：A解析：P/V與kLa呈冪律正相關(guān)，保持P/V可使溶氧傳遞能力隨體積線性放大；但剪切與混合時間仍會變。9.下列哪種層析模式最適合捕獲高唾液酸化修飾的融合蛋白？A.疏水相互作用層析（HIC）B.金屬螯合層析（IMAC）C.陰離子交換層析（AEX）D.羥基磷灰石層析（CHT）答案：C解析：唾液酸帶負(fù)電，高唾液酸化使蛋白整體pI降低，與AEX介質(zhì)結(jié)合更強；HIC、IMAC、CHT無此選擇性。10.對ADC藥物而言，DAR（drug-to-antibodyratio）過高最可能引起：A.體內(nèi)快速酶解B.聚集傾向增加、血漿清除加快C.靶點結(jié)合親和力下降D.連接子化學(xué)不穩(wěn)定答案：B解析：高載藥量顯著增加疏水性，導(dǎo)致ADC聚集、易被肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除；親和力與連接子穩(wěn)定性主要與位點及化學(xué)類型相關(guān)。二、配伍選擇題（每空1.5分，共15分）A.離子交換層析B.親和層析C.反相層析D.分子篩層析E.疏水層析11.從細(xì)胞培養(yǎng)上清中一步捕獲含F(xiàn)c片段的抗體，首選____。12.檢測ADC藥物中游離小分子毒素殘留，常用____。13.去除聚集體、獲得單體峰，工業(yè)上多用____。14.分離電荷異構(gòu)體（酸性/堿性峰），可采用____。15.高鹽條件下結(jié)合、低鹽條件下洗脫，屬____機理。答案：11-B；12-C；13-D；14-A；15-E解析：11.ProteinA為經(jīng)典Fc親和配基；12.RP-HPLC對疏水小分子毒素靈敏度高；13.SEC按分子大小分離，可去聚集體；14.不同電荷變體與IEX介質(zhì)結(jié)合力差異大；15.HIC在高鹽促進疏水相互作用。三、名詞解釋（每題4分，共20分）16.糖型（Glycoform）答案：指同一多肽鏈因糖基化位點、糖鏈結(jié)構(gòu)或末端糖殘基差異而形成的多種分子形式；糖型可影響蛋白折疊、穩(wěn)定性、半衰期及免疫效應(yīng)功能。17.高甘露糖型（High-mannoseglycan）答案：N-糖鏈中五糖核心外側(cè)連接2–6個甘露糖殘基、缺乏復(fù)雜型或雜合型修飾的結(jié)構(gòu)；高甘露糖型通常通過甘露糖受體加速肝脾清除，縮短半衰期。18.臨界聚集溫度（Tagg）答案：在可控升溫條件下，蛋白溶液散射光強度（或光學(xué)密度）開始急劇上升所對應(yīng)的溫度，用于評估膠體穩(wěn)定性；Tagg越高，預(yù)示長期儲存中越不易形成可見或亞可見顆粒。19.空殼病毒（Emptycapsid）答案：病毒樣顆粒或真實病毒顆粒中不含核酸基因組的衣殼結(jié)構(gòu)；在基因治療病毒載體生產(chǎn)中，空殼為關(guān)鍵雜質(zhì)，需通過離子交換或密度梯度離心去除，以降低免疫原性并提高感染滴度比。20.生物類似藥（Biosimilar）答案：與已上市“參照藥”在質(zhì)量、安全性和有效性上高度相似的生物制品；需通過全面可比性研究（理化、功能、臨床PK/PD、免疫原性等）證實相似性，而非傳統(tǒng)小分子仿制藥的簡單BE試驗。四、簡答題（每題8分，共24分）21.簡述影響單抗電荷異構(gòu)體形成的主要化學(xué)降解途徑，并給出質(zhì)控策略。答案：1.脫酰胺：Asn→Asp/IsoAsp，導(dǎo)致+1電荷丟失，形成酸性峰；高溫高pH加速。2.琥珀酰亞胺中間體環(huán)化：Asp→IsoAsp，骨架彎曲，可伴隨+1電荷變化。3.C端賴氨酸剪切：重鏈C端-Lys去除，導(dǎo)致-1電荷，形成酸性峰；由堿性羧肽酶或培養(yǎng)pH影響。4.游離巰基氧化：形成二硫鍵錯配或三硫鍵，局部構(gòu)象變化，可影響離子化微環(huán)境。質(zhì)控策略：a.建立陽離子交換（CEX-HPLC）或毛細(xì)管等電聚焦（cIEF）放行標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定酸性/主峰/堿性比例范圍；b.優(yōu)化上游pH、離子強度及收獲時間，減少脫酰胺；c.采用C端賴氨酸基因敲除宿主或添加羧肽酶抑制劑；d.對關(guān)鍵批次開展肽圖（LC-MS）定位，確認(rèn)變異位點；e.通過強制降解試驗建立警戒閾值，關(guān)聯(lián)活性/藥代，確保臨床一致性。22.比較“灌流培養(yǎng)”（Perfusion）與“流加培養(yǎng)”（Fed-batch）在商業(yè)化生產(chǎn)單抗時的經(jīng)濟與技術(shù)差異。答案：1.設(shè)備規(guī)模：Perfusion需連續(xù)收獲、細(xì)胞截留裝置（TFF/ATF），初始投資高；Fed-batch僅需一次性或不銹鋼罐，放大簡單。2.產(chǎn)量密度：Perfusion可維持50–150×10?cells/mL，日產(chǎn)量高；Fed-batch峰值20–30×10?cells/mL，體積產(chǎn)率較低。3.培養(yǎng)周期：Perfusion可連續(xù)運行30–80d，但需嚴(yán)格無菌控制；Fed-batch通常12–16d，污染風(fēng)險窗口短。4.下游負(fù)荷：Perfusion收獲液體積大、蛋白濃度低（1–3g/L），需連續(xù)捕獲或更大層析柱；Fed-batch終濃度5–10g/L，體積相對小。5.質(zhì)量影響：Perfusion可快速移除乳酸、氨，糖型更均一；Fed-batch末期代謝副產(chǎn)物累積，酸性峰偏高。6.經(jīng)濟性：Perfusion節(jié)省生物反應(yīng)器體積，但耗材（濾器、培養(yǎng)基）成本高；Fed-batch設(shè)備折舊低，但需更大廠房。7.法規(guī)：灌流工藝變更需連續(xù)生產(chǎn)驗證，監(jiān)管復(fù)雜；流加工藝成熟，申報路徑清晰。結(jié)論：對超高產(chǎn)量或不穩(wěn)定蛋白，灌流更具優(yōu)勢；對傳統(tǒng)單抗，F(xiàn)ed-batch仍是主流。23.說明ADC藥物“連接子-有效載荷”設(shè)計中，如何平衡血漿穩(wěn)定性與腫瘤內(nèi)釋放。答案：1.連接子類型：a.不可裂解（如硫醚、馬來酰亞胺-己酰）：依賴溶酶體完全降解抗體，釋放氨基酸-連接子-藥物；血漿穩(wěn)定高，但活性代謝物疏水，易外排。b.可裂解：i.酸敏感腙鍵（pH≈5解離）：血漿pH7.4穩(wěn)定，溶酶體/內(nèi)體微酸環(huán)境裂解；但腙鍵水解半衰期短，可能提前釋放。ii.蛋白酶敏感二肽（Val-Cit,Val-Ala）：被溶酶體組織蛋白酶B識別，血漿中蛋白酶活性低，穩(wěn)定性好；為當(dāng)前主流。iii.二硫鍵：依賴胞內(nèi)高GSH濃度（1–10mM）還原，血漿GSH低（<10μM），但血漿蛋白-SH可催化交換，穩(wěn)定性中等。2.空間位阻：在連接子鄰近引入甲基或PEG化，降低非特異水解酶接觸，提高t1/2。3.藥物疏水屏蔽：將極性磺酸基或磷酸基引入連接子，降低DAR>6時的聚集傾向，同時維持裂解效率。4.體外評價：a.人、猴、小鼠血漿37℃孵育7d，游離藥物<1%；b.溶酶體勻漿（pH5.0+CathepsinB）37℃1h，釋放≥80%；c.細(xì)胞毒性：抗原陽性IC50比陰性低100倍以上。5.體內(nèi)驗證：血漿PK與裸抗體相似，腫瘤/血漿藥物濃度比>10；毒性試驗中骨髓抑制、神經(jīng)毒性可控。平衡策略總結(jié)：優(yōu)先選擇Val-Cit+對氨基芐基自降解間隔子，配合中等疏水微管抑制劑（MMAE,MMAF），DAR3–4，兼顧穩(wěn)定與療效。五、計算題（共21分）24.某50kDa單抗在2L搖瓶中進行流加培養(yǎng)，第12天收獲，測得滴度5g/L，細(xì)胞終密度25×10?cells/mL，細(xì)胞活率90%。已知培養(yǎng)過程累計消耗葡萄糖400g，乳酸累積峰值3.2g/L。(1)計算單位細(xì)胞產(chǎn)率（qP，pg/cell/day）；（6分）(2)若工藝放大至500L，目標(biāo)收獲滴度不變，求所需總葡萄糖（kg），假設(shè)葡萄糖/抗體質(zhì)量消耗比恒定；（3分）(3)若采用連續(xù)灌流，維持細(xì)胞密度80×10?cells/mL，日收獲1個罐體積（1VVD），穩(wěn)態(tài)滴度4g/L，求達(dá)到與500L流加同等年產(chǎn)能（kg）所需最小灌流體積（L），年運行300d。（12分）答案：(1)總抗體=5g/L×2L=10000mg總活細(xì)胞×天=∫Xvdt，近似梯形積分：初始0.3×10?，終25×10?，平均≈12.65×10?cells/mL×2L=25.3×10?cellsqP=10000mg/(25.3×10?cells×12d)=33pg/cell/day(2)葡萄糖/抗體=400g/10g=40500L收獲5g/L→2500g抗體需葡萄糖=2500g×40=100000g=100kg(3)年產(chǎn)能流加：2.5kg/批次，若每批次14d（含清洗），年批次數(shù)=300/14≈21.4→21批總產(chǎn)能=2.5kg×21=52.5kg/年灌流日產(chǎn)能=4g/L×1VVD×VL=0.004Vkg/d年產(chǎn)能=0.004V×300=1.2Vkg令1.2V≥52.5→V≥43.75L取最小整數(shù)44L答案：(1)33pg/cell/day；(2)100kg；(3)44L六、綜合論述題（20分）25.某生物制藥公司擬將一款抗HER2單抗從“3×1000L不銹鋼流加”變更為“1×2000L一次性灌流”，要求年產(chǎn)量≥800kg，且質(zhì)量可比。請從工藝、設(shè)備、質(zhì)量、法規(guī)、經(jīng)濟五方面制定完整技術(shù)轉(zhuǎn)移路線圖，并給出關(guān)鍵里程碑與風(fēng)險控制點。答案：一、工藝設(shè)計1.細(xì)胞株：沿用已驗證CHO-K1，但引入抗凋亡Bcl-2共表達(dá)，提高灌流存活率。2.培養(yǎng)模式：ATF-TFF交替切向流，截留0.2μm，1VVD灌流速率，穩(wěn)態(tài)80×10?cells/mL，滴度目標(biāo)5g/L。3.下游：a.連續(xù)捕獲：周期性逆流蛋白A（PCC），4×25cm直徑柱，循環(huán)時間4h，載量25g/L；b.病毒滅活：低pH3.6，連續(xù)流管道反應(yīng)器，停留30min；c.精純：連續(xù)AEX（MCS）+VI病毒過濾，整合在線OD280、電導(dǎo)監(jiān)測。4.年運行：300d，設(shè)備利用率85%，年收獲體積=2000L×1×300×0.85=510000L總抗體=510000L×5g/L=2550kg，滿足800kg需求（含下游收率70%→1785kg）。二、設(shè)備與工程1.2000L一次性生物反應(yīng)器（SUS），磁力攪拌，激光溶氧、pH、溫度電極；2.ATF-10系統(tǒng)，配0.2μm中空纖維，自動反沖；3.連續(xù)層析skid，配4柱位PCC閥組；4.在線稀釋系統(tǒng)，實現(xiàn)3×濃縮緩沖液實時稀釋，降低儲罐體積；5.關(guān)鍵公用工程：WFI10m3/h，CDA7bar，CO?99.9%，冷凍乙二醇-5℃。三、質(zhì)量與可比性1.質(zhì)量目標(biāo)概況：a.一級結(jié)構(gòu)：肽圖覆蓋率≥95%，無新增修飾；b.糖型：G0F≤55%，G1F25–40%，Man5≤5%；c.電荷異構(gòu)體：酸性峰≤25%，堿性峰≤20%；d.聚集體：SEC單體≥98%；e.效價：ADCC與參照藥比值0.8–1.