1、第5章連、轉(zhuǎn)、篩,一、DNA片段的重組連接目的基因和載體DNA是重組的基本構(gòu)件。DNA片斷的重組連接是目的基因與載體的連接。獲得目的基因后必須將其放在一定的載體上才能進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)。載體（bus）將目的基因（乘客）送到宿主細(xì)胞（理想的天堂）去繁衍生息，春花秋實(shí)，建功立業(yè)。習(xí)慣上將目的基因與載體連接及其后續(xù)的轉(zhuǎn)化過(guò)程稱(chēng)為克隆，可能是目的基因載體形成一個(gè)新的DNA重組分子（新的genotype），后者必然會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的菌體克?。╬henotype）。,限制酶剪切或機(jī)械剪切目的基因或載體可以產(chǎn)生粘端和平端的DNA分子。催化二者重組連接（粘端或平端）反應(yīng)的酶常用T4DNAligase。,（一）

2、粘性末端連接1.利用相同的酶切位點(diǎn)單酶單切點(diǎn)用同一種酶分別切割目的基因/載體，然后進(jìn)行連接。優(yōu)點(diǎn)：二者產(chǎn)生相同的粘性末端，彼此很易按堿基配對(duì)退火，在ligase作用下生成DNA分子重組體。geneEcoRvectorEcoR問(wèn)題與解決辦法：（1）自身環(huán)化粘性末端自發(fā)形成雙鏈，連接產(chǎn)物含大量的目的基因和載體自身環(huán)化的假重組體若轉(zhuǎn)化則出現(xiàn)假陽(yáng)性克隆。解決辦法是用高濃度的DNA（目的基因：載體為3：1）和堿性磷酸酶（AP：BIP/CIP）處理載體，去除5P使之不能自身環(huán)化，缺口在宿主內(nèi)可得到修復(fù)。（2）不能定向克隆/插入由于是單一位點(diǎn)，目的基因可以以不同方向插入載體。對(duì)于克隆擴(kuò)增問(wèn)題不大，因?yàn)榭寺∩?/p>

3、去的基因再重組時(shí)又要切下來(lái)；對(duì)于表達(dá)載體目的基因必須按53方向克隆在啟動(dòng)子下游而不能反之。此時(shí)只能靠運(yùn)氣了。,2.利用不同的酶切位點(diǎn)雙酶雙切點(diǎn)（定向克?。﹥?yōu)點(diǎn)（1）避免載體/目的基因的自身環(huán)化，提高連接效率；（2）可控制外源基因插入方向。構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)最好使用雙酶雙切點(diǎn)，這樣方式也稱(chēng)定向克隆。如：目的基因和載體都有EcoR，Pst酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生各自互補(bǔ)粘端，分別配對(duì)連接。E.coRgenePstEcoRvectorPst3.利用同裂酶，分別切割目的基因/載體，產(chǎn)生相同粘端，因而可以連在一起，如：5GGATCC3Saw3AIgeneBamHIvector3CCTAGG5構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，同裂酶也很

4、有用。,ligase,(xbalI)EcoRI,EcoRI(HindIII),PUC,(xbalI),EcoRI,(HindIII),EcoRI,EcoRI,+,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,DigestionwithEcoRI,RecoveryofAPPAIDNAframagarose,APOAI,PUCQ-APOAI,PBR325-APOAI,PUC9,PUC9,APOAI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,EcoRI,Figure8-3strategyofconstructionofrecombinantpucq-APOAIplasmia,E.coli,*4.（1）3

5、端突出只能切平是因?yàn)镈NApol合成需要引物（加在3OH末端）且只能按53方向。（2）切平填平圖示：5合成填平53切平35核酸酶切平355突出末端3突出末端（3）切平除用于重組連接外，還可用于閱讀框修改，如：EcoR5GATCGAATTC35GATCG-1.目的基因、載體平端平端直接連接沒(méi)有合適的產(chǎn)生粘端的限制酶切位點(diǎn)，可采用平端連接，但連接效率粘端。并且連接反應(yīng)中更偏向于載體自身環(huán)化，擬用下述措施可提高連接效率。措施：（1）大大增加ligase量，有人估算是粘端同等條件的100倍。（2）增加目的基因DNA分子量，增加與載體碰撞的機(jī)會(huì)。（3）BIP或CIP去除載體兩端5P基團(tuán)，防止環(huán)化。,（二

6、）平頭末端的連接,平端目的基因DNAEcoR甲基化酶加linker（已磷酸化加了5P）PGGAATTCCGGAATTCCCCTTAAGGCCTTAAGGPT4ligase平端連接形成交聚接頭GGAATTCCGGAATTCCCCTTAAGGCCTTAAGGGGAATTCCGGAATTCC-CCTTAAGGCCTTAAGG-EcoRIAATTCCGGGGCCTTAA在目的基因末端連上人工接頭與同樣酶切（EcoR）的載體連接,2.加人工接頭連接人工接頭（linker，接頭）是指人工合成的，連接目的基因兩端的含有某些限制酶位點(diǎn)的寡核苷酸片段，如含EcoR的linker與目的基因的連接圖示如下。,*采用

7、此方法可能存在下述問(wèn)題：目的基因含1個(gè)或多個(gè)與linker相同的酶切位點(diǎn)如EcoR，將受到損害，克服辦法有：（1）加linker前用甲基化酶保護(hù)目的基因（如EcoR甲基化酶）。(2)用哺乳動(dòng)物DNA切點(diǎn)稀少的限制酶切位點(diǎn)合成linker如Sal/Not，平均100/1000bp才可能出現(xiàn)1個(gè)酶切位點(diǎn)。這樣目的基因被切幾率就很小。（3）用adaptor取代linker連接。,3.用銜接頭代替人工接頭連接（adaptor與linker區(qū)別是本章第一個(gè)難點(diǎn)）銜接頭（adaptor，套頭，適應(yīng)子）是一種人工合成的短雙鏈寡脫氧核苷酸，一端是可與目的基因雙鏈（如cDNA）連接的平頭末端，一端是可與載體連接

8、的粘性末端。與linker不同，在加到cDNA分子之后套頭不需要用限制酶降解，與脫磷酸化具有同樣粘性末端的載體相連。Linker（多聚接頭）或adaptor（多聚套頭）的限制酶切下的小片段或銜接形成的雙體套頭可用電泳或?qū)游龇ǚ蛛x，以后者得到推薦。adaptorgeneadaptorvector,4.通過(guò)同源多聚尾連接dC：dG同源多聚尾是連接DNA片段克隆cDNA的有效方法。（1）目的基因?yàn)槠蕉藭r(shí)，5CTGCAGpstI核酸外切酶或Pst消化生成3OH的單鏈末端，在TdT末端轉(zhuǎn)移酶作用下生成同聚尾dC；(3GACGTC（2）載體Pst內(nèi)切生成3粘端，TdT作用下加上同聚尾dG；（3）目的基因/

9、載體混火退火生成cDNA，其末端間隙導(dǎo)入宿主中可自行修復(fù)。（4）rDNA中cDNA兩端各形成一個(gè)Pst位點(diǎn)，便于cDNA切出（克?。?。,5.T載體（A/T克隆法）在克隆PCR產(chǎn)物cDNA時(shí)可采用這一方法。（1）cDNA末端添加AA利用Taqpol延伸活性，以不依賴(lài)模板的方式在已完成延伸的PCR產(chǎn)物的3端添加AA（利用DNApol活性可成）。（2）末端為T(mén)T的線性化的T載體可用下述4種方法得到：Mbc、Xcm或Hph酶切產(chǎn)生單個(gè)T突出末端；用TdT將T加到酶切產(chǎn)生的平端的載體上；利用Taqpol的延伸活性，為了得到TT，在模板上先加上AA；T載體已商品化、買(mǎi)。,二、重組DNA（rDNA）導(dǎo)入受體

10、細(xì)胞（一）序言1.導(dǎo)入目的（1）克隆擴(kuò)增rDNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，利用宿主的生理?xiàng)l件，克隆擴(kuò)增，克隆片段隨著載體（如質(zhì)粒）一起擴(kuò)增獲得擴(kuò)增DNA片段（如細(xì)菌分裂繁殖）。（2）克隆表達(dá)利用宿主的生理?xiàng)l件，生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品或開(kāi)展基因治療。受體細(xì)胞接受rDNA分子稱(chēng)作受體細(xì)胞或宿主細(xì)胞有2種（1）原核細(xì)胞既可以復(fù)制擴(kuò)增，也可以基因表達(dá)。（2）真核細(xì)胞一般只用作基因表達(dá)系統(tǒng)。2.受體細(xì)胞的基本條件(1)易接納rDNA分子；(2)對(duì)載體復(fù)制擴(kuò)增無(wú)嚴(yán)格限制；(3)不降解，不修飾外源DNA分子。3.轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染（transformation/transfection）注：transformation質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程；transfection噬菌體，病毒或以它作為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入；transduction以噬菌體為媒介導(dǎo)入外源DNA分子。,物理方法（電擊轉(zhuǎn)化）,物理法：當(dāng)大腸桿菌暴露在電荷中時(shí)，其細(xì)胞膜會(huì)不