1、熒光實(shí)時(shí)定量PCR rt-qPCR,定義 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(rt-qPCR)： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化對(duì)PCR過程進(jìn)行 實(shí)時(shí)監(jiān)控，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。,Rt-qPCR的應(yīng)用,mRNA表達(dá)的研究 微小殘留病變的檢測 腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究 病毒感染的定量監(jiān)測,PCR基本原理,試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，依據(jù) 1.DNA半保留復(fù)制的機(jī)理 2.體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì) 通過人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，使 1.雙鏈DNA變成單鏈 2.單鏈DNA與人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。,基本步驟 變性：加熱使雙

2、鏈DNA變?yōu)閱捂湥?4，30s） 退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部形成雜交鏈 （55，30s） 延伸：耐熱DNA聚合酶按53方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)（7072，3060s）,示意圖,Real-time定量PCR儀是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測和連續(xù)地分析整個(gè)PCR進(jìn)程，隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，監(jiān)測到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量的分析。,SYBR Green,SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位，只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)出熒光，DNA雙鏈分開就不發(fā)出熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)物量的增多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)逐

3、漸增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)與產(chǎn)物量的關(guān)聯(lián)。,理論上來說，PCR反應(yīng)過程中生成的DNA產(chǎn)物是呈指數(shù)方式增加的，即每增加一個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物加倍。但隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，產(chǎn)物積累、原料消耗，最終PCR反應(yīng)無法繼續(xù)維持指數(shù)方式的擴(kuò)增，而進(jìn)入線性期和平臺(tái)期。整個(gè)PCR反應(yīng)過程中，只有在指數(shù)期，PCR產(chǎn)物的量與加入的初始模板量存在明確的數(shù)學(xué)關(guān)系（PCR產(chǎn)物量=初始模板量2N，N=循環(huán)數(shù)），因此，利用公式，可以由產(chǎn)物的量精確推算出初始模板量的多少。而在線性期和平臺(tái)期，PCR產(chǎn)物量和初始模板量之間不存在準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)關(guān)系，由這兩個(gè)時(shí)期的產(chǎn)物量來推算初始模板量的多少是不準(zhǔn)確的。,在相同的條件下，進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，每擴(kuò)增一

4、個(gè)循環(huán)，通過檢驗(yàn)熒光來檢測每個(gè)孔里目標(biāo)基因片段的含量，記錄每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（樣本的域值循環(huán)數(shù)Ct），次數(shù)越多就說明目標(biāo)基因在原本的樣品里越少，即初始模板的量越少。,logX= n (1+E)+logX0,實(shí)驗(yàn)步驟,1、把要測的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，決定要跑的基因和使用的內(nèi)參序列，排好板的順序。 2、準(zhǔn)備好DNA樣本，水，sybr，前后引物，融化，離心。 3、計(jì)算樣本混合物（每個(gè)孔加sybr10ul、cDNA30ug、水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每個(gè)孔加前后引物各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合樣本，sybr，水。按比例混合前后引物。 4、

5、按照排板的順序往板內(nèi)加樣本混合物，每孔18.4微升，加完后按排板順序加相應(yīng)的前后引物混合物，每孔1.6微升。 5、貼膜，離心，上機(jī)，Real Time PCR擴(kuò)增結(jié)束后輸出對(duì)照組和待測組的目的基因及內(nèi)參基因的CT值。,即實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)相較于對(duì)照組上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)。,熒光定量PCR如何減小誤差,1、校準(zhǔn)生物學(xué)誤差：內(nèi)參(管家基因) 2、降低隨機(jī)誤差,1、校準(zhǔn)生物學(xué)誤差內(nèi)參(管家基因),內(nèi)參基因(Endogenous Control) 用于校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)過程中樣品本身對(duì)定量結(jié)果的影響 原因：核酸提取時(shí)通常以重量，體積或細(xì)胞數(shù)為單位取 樣，提取過程中存在得率差異和操作誤差，造成 等量樣品不一定獲得等量提取物 目的：將定量結(jié)果校準(zhǔn)為以基因組（或單個(gè)細(xì)胞）為 單位，不同樣品之間才