1、 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凱氏定氮法(Kjedahl）、雙縮脲法(Biuret)、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)。其中Bradford法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍Biuret法靈敏100倍以上。 凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。1. 凱氏定氮法11 原理 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定4個(gè)過程。其原理是樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化，含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨，氨又與 酸作用，變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨，氨用過

2、量的硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。12 特點(diǎn) 凱氏定氮法是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是測(cè)定試樣中總有機(jī)氮最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，被國(guó)際國(guó)內(nèi)作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。該凱氏定氮法適用范圍廣泛，用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定，干擾少，干擾是非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離）測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)，通常8-10個(gè)小時(shí)，靈敏度低，測(cè)定范圍是0.2-1.0mg。2. 雙縮脲法21 原理 雙縮脲(NI3C0NHC0NH 是兩個(gè)分子脲經(jīng)180左右加熱，放出1個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO 形成紫色絡(luò)合物

3、，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能夠以1個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。2.2特點(diǎn) 雙縮脲法中樣品的取用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響.采用05 g樣品，40 mL雙縮脲試劑的比例具有較高的檢測(cè)精度。雙縮脲法對(duì)不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，不受溫度的影響?？煽焖贉y(cè)定蛋白質(zhì)含量，試劑單一，方法簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，如硫酸銨，Tris緩沖液，某些氨基酸。但靈敏度差，測(cè)定范圍為l2O mg蛋白質(zhì)，20-30min。適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定，

4、常用于谷物蛋白質(zhì)含量測(cè)定。3. 紫外光吸收法31 原理 蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收峰在280 nm處，其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238 nrll的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。32 特點(diǎn) 最常用的紫外吸收法是280 nm的光吸收法，紫外吸收法簡(jiǎn)便、較靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定，測(cè)定后仍能回收使用。較高靈敏，測(cè)定范圍是50-100ug，用于層析柱流出液的檢測(cè)，時(shí)間較快，5-10min。缺點(diǎn)是，準(zhǔn)

5、確度較差，干擾物質(zhì)多，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸關(guān)，等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。紫外吸收法測(cè)定時(shí)， 由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測(cè)定樣品時(shí)的pH要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。4.考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)4.1 原理Bradford法是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。考馬斯亮藍(lán)是一種有機(jī)染料

6、，在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)從465 nm變?yōu)?95 nm，蛋白質(zhì)在11 000 u g范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)一色素結(jié)合物在595 nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。4.2 特點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速而穩(wěn)定，2 min左右即達(dá)到平衡其結(jié)合物室溫下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定，且在520 min之間，顏色的穩(wěn)定性最好，顏色深淺隨蛋白質(zhì)不同而變化該法方法簡(jiǎn)便，易于操作，所用試劑較少，顯色劑易于配制。干擾物質(zhì)少，如糖、緩沖液、還原劑和絡(luò)合劑等均不影響顯色，靈敏度高，測(cè)定范圍是1-5ug。速度快，5-15min。此法的缺點(diǎn)是由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用