1、RNAi的實驗方法,細(xì)胞生物學(xué) 2014.11.14,目錄,miRNA的原理及機(jī)制 RNAi的機(jī)制及與miRNA的關(guān)系 RNAi實驗的三大基本路線 RNAi機(jī)制的缺陷,miRNA的原理,MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約2025個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病

2、毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。,miRNA如何行使功能？,與mRNA的3端非編碼區(qū)特定位點(其第28個核苷酸)綁定： 與mRNA完全互補時會引發(fā)mRNA降解； 不完全的與mRNA配對時，會引發(fā)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（抑制靶基因的表達(dá)） 從而抑制或阻止相應(yīng)的mRNA翻譯過程。,miRNA途徑： miRNA可以降解mRNA，或者抑制mRNA翻譯蛋白質(zhì),RNAi借用了天然的miRNA作用途徑,RNAi作用機(jī)制,RNAi實驗 三大基本路線,線路一：非哺乳動物細(xì)胞體系的RNAi實驗和選擇,比如果蠅，線蟲，擬南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過體外轉(zhuǎn)錄即可制備目標(biāo)

3、基因的dsRNA（200bp左右），直接用長雙鏈RNA進(jìn)行RNAi實驗。,（1）構(gòu)建目的基因載體，選取目的基因的特異性序列（約200bp300bp），構(gòu)建到T載體上。 （2）使用5端連接有T7啟動子的引物PCR擴(kuò)增目的基因，得到兩端均連接有T7啟動子 序列的目的基因片段。 （3）T7RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。dsRNA、ssRNA、DNA模板。 （4）加入Rnase 和Dnase消除ssRNA和DNA模板。 （5）離心純化dsRNA。,siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法,對于線蟲而言，,線路二：哺乳動物細(xì)胞RNAi實驗：siRNA的設(shè)計，合成,哺乳動物細(xì)胞導(dǎo)入30bp以上的長雙鏈RNA（dsRNA），往往會

4、誘發(fā)非預(yù)期的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，所以不能用體外合成的dsRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞，常見的做法之一是直接制備1927bp左右的siRNA，然后再將siRNA轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞。,siRNA的轉(zhuǎn)染,哺乳動物轉(zhuǎn)染的常見方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、機(jī)械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質(zhì)體試劑，其中陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染法是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法。,siRNA的轉(zhuǎn)染,有些研究人員發(fā)現(xiàn)，攜帶siRNA的脂蛋白納米顆粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，一旦納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞，就會被捕獲在小泡中，這阻礙了大部分siRNA接近位于細(xì)胞質(zhì)的目標(biāo)mRNA。甚至?xí)谝恍r內(nèi)將其分解并排出細(xì)胞。,siRNA的轉(zhuǎn)染,研究顯示，在納米顆粒的再

5、利用過程中，蛋白NPC1 是一個主要因子。沒有這一蛋白，納米顆粒就不會被細(xì)胞排出，讓siRNA有更多的時間去結(jié)合目標(biāo)mRNA。NPC1缺乏時會出現(xiàn)交通擁堵，這樣siRNA就有更多的時間逃逸出來，但也會影響細(xì)胞的其他生理活動，所以現(xiàn)在大部分研究人員都在通過改進(jìn)脂蛋白納米顆粒的結(jié)構(gòu)，來增強(qiáng)siRNA的轉(zhuǎn)染效率。,線路三：shRNA 表達(dá)載體和病毒載體,這類載體都包含有一個RNA聚合酶 啟動子和一個45個連續(xù)的T構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄終止位點以及選擇標(biāo)記，選用Pol 啟動子是因為此啟動子總是在距其一定距離的位置起始轉(zhuǎn)錄，而遇到45個連續(xù)的T就終止轉(zhuǎn)錄，并且終止于轉(zhuǎn)錄終止位點第二個堿基處，十分精確。,此法需首先化

6、學(xué)合成一段編碼siRNA 正義和反義鏈的模板，正義與反義序列之間由一段環(huán)(1oop)序列隔開。插入載體Pol 啟動子下游，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，環(huán)序列可使轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈折疊成具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA分子（shRNA） ，這些小RNA可被細(xì)胞內(nèi)的Dicer切割為長21bp的siRNA。,RNAi作為一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制，廣泛應(yīng)用于基因功能研究，腫瘤及病毒感染性疾病治療的實驗研究，其核心內(nèi)容是siRNA能夠抑制同源基因的表達(dá)。對于siRNA 而言，現(xiàn)在頗有爭議的地方在于它對靶基因的沉默特異性，主要體現(xiàn)在兩個方面： （1）脫靶效應(yīng)。 （2）打破內(nèi)源性miRNA的平衡。,RNAi機(jī)制的缺陷,脫靶效應(yīng),即siRNA 對靶基因的沉默并不一定嚴(yán)格按照序列特異性方式進(jìn)行。 （1）對于21-23nt 的siRNA，只需少至7nt 的序列與mRNA 同源，均可導(dǎo)致該基因的沉默。 （2）誘導(dǎo)機(jī)體或細(xì)胞產(chǎn)生天然或獲得性免疫應(yīng)答，被一些蛋白酶降解，從而降低siRNA 對靶基因的特異性。,降低siRNA 脫靶效應(yīng),（1）要減少脫靶效應(yīng)，可以將針對同一mRNA的不同siRNA混合起來使用。這些siRNA作用于同一個目標(biāo)，每種siRNA的濃度得以降低，稀釋了各自的脫靶效應(yīng)，但不損害靶的特異性敲除。,（2）對siRNA的化學(xué)修飾,siRNA的化學(xué)修飾主要有三類： 磷酸骨架修飾 （如硫代修飾，增強(qiáng)抵