1、設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的制備的實(shí)驗(yàn)方案制藥1302閆敏一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思想金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）。有“嗜肉菌的別稱?？梢鹪S多嚴(yán)重感染。細(xì)菌按形態(tài)可分為：球菌，桿菌，和螺旋菌。金黃色葡萄球菌就是球菌的一種。它是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表。革蘭氏陽(yáng)性菌就是可以被結(jié)晶紫初染，碘液媒染，乙醇脫色，沙黃（紅色）復(fù)染后呈現(xiàn)紫紅色的細(xì)菌。而革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。這些差別源于金黃色葡萄球菌具有陰性菌所沒有的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。相反，陰性菌沒有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)

2、。1葡萄球菌屬（Staphylococcus）至少包括有20個(gè)種。其中金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，引起許多嚴(yán)重感染。典型的金黃色葡萄球菌為球形，直徑0.8m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無(wú)芽孢、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色陽(yáng)性。是一種不利于人體的細(xì)菌。金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37，最適生長(zhǎng)pH 7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10%-15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)?？煞纸馄咸烟?、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，VP

3、反應(yīng)弱陽(yáng)性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。在干燥環(huán)境中存活數(shù)月；空氣中存在，但不繁殖。耐熱性強(qiáng)，加熱701h，8030min不被殺死；耐低溫，在冷凍食品中不易死亡；耐高滲，在含有50%-66%蔗糖或15%以上食鹽食品中才可被抑制，能在15%NaCl和40%膽汁中生長(zhǎng)。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類藥物敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。 金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布于自然界，可以引起人和動(dòng)物的感染。在人體主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股溝、會(huì)陰部和新生兒臍帶殘端等部位，偶爾也寄生于口咽部、皮膚、腸道及陰道口等，是醫(yī)院感染常見的病原體之一。在醫(yī)院里，耐甲

4、氧西林和其他抗生素的金黃色葡萄球菌廣泛流行，對(duì)萬(wàn)古霉素不敏感的菌株也有所增加，給臨床治療帶來(lái)了很大的困難。金黃色葡萄球菌除了引起感染外，其產(chǎn)生的腸毒素可污染食物而致食物中毒，為人類帶來(lái)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān) 包括：原因、研究?jī)r(jià)值或意義等。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄍC合實(shí)驗(yàn)）2.1學(xué)習(xí)培養(yǎng)基的制作過程和注意事項(xiàng)。2.2學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基和倒平板。2.3學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌過程和使用方法。2.4學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。三、實(shí)驗(yàn)基本流程（可畫流程圖）稱藥品溶解調(diào)pH值融化瓊脂過濾分裝包扎標(biāo)記滅菌擺斜面或倒平板。四、實(shí)驗(yàn)原理4.1微生物的營(yíng)養(yǎng)類型光能自養(yǎng)型的微生物可在完全無(wú)機(jī)的環(huán)境中生長(zhǎng)，以CO2為碳源，光做能源，無(wú)機(jī)物為供

5、H體還原CO2合成細(xì)胞有機(jī)物質(zhì)的微生物?？梢灾苯永霉饽馨褵o(wú)機(jī)物轉(zhuǎn)化成自身需要的糖類等有機(jī)物，比如藍(lán)藻?；茏责B(yǎng)型的微生物可以在完全無(wú)機(jī)的環(huán)境中生長(zhǎng)發(fā)育，以無(wú)機(jī)化合物氧化為時(shí)釋放的能量為能源，以CO2或碳鹽為碳源，合成細(xì)胞物質(zhì)的微生物。這類細(xì)菌包括硫細(xì)菌、硝化細(xì)菌、鐵細(xì)菌等，硫細(xì)菌和硝化細(xì)菌與生產(chǎn)密切相關(guān)。所以我們的生活是依賴微生物的。 對(duì)于異養(yǎng)型微生物： 光能異養(yǎng)型微生物，這類微生物具有光合色素。能利用光做能源，以有機(jī)化合物為供H體，還原CO2，合成細(xì)胞物質(zhì)的微生物。光能異養(yǎng)微生物能利用CO2，但必須在有機(jī)物存在的條件下，才能生長(zhǎng)，人工培養(yǎng)還需供給生長(zhǎng)因素。目前已用這類微生物，如紅螺菌來(lái)凈化

6、高濃度有機(jī)廢水，這對(duì)處理污水、凈化環(huán)境，很有發(fā)展前途。 化能異養(yǎng)型微生物，這類微生物以有機(jī)化合物為碳源，利用有機(jī)化合物氧化過程中產(chǎn)生的能量為能源，以有機(jī)或無(wú)機(jī)含氮化合物為氮源，合成細(xì)胞物質(zhì)。由于棲息場(chǎng)所和攝取養(yǎng)料不同，可將異養(yǎng)微生物分為腐生型和寄生型兩大類。 腐生型：利用無(wú)生命的有機(jī)物獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 寄生型：從活的寄生體內(nèi)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如病毒。 中間類型（兼性腐生或兼性寄生）如結(jié)核桿菌、痢疾桿菌就是兼性寄生菌 自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物的區(qū)別不在能否利用CO2，而 在于是否以CO2為唯一或主要碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。自養(yǎng)型微生物以無(wú)機(jī)碳化物為碳源，但也可能也可以利用有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)。異養(yǎng)型微生物雖然也可利

7、用CO2，但必須在有機(jī)碳存在情況下。有些微生物在不同生4.2營(yíng)養(yǎng)進(jìn)入微生物的方式 擴(kuò)散(diffusion) 原生質(zhì)膜是一種半透性膜，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過原生質(zhì)膜上的小孔，由高濃度的胞外環(huán)境向低濃度的胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散。是非特異性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收方式。 特點(diǎn):在擴(kuò)散過程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化不消耗能量,不能逆濃度運(yùn)輸運(yùn)輸,速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比, 細(xì)胞膜的特性、膜上含水小孔的大小和形狀對(duì)被擴(kuò)散的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分子的種類、大小有一定的選擇性。物質(zhì)跨膜擴(kuò)散的能力和速率與物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān),分子量小、脂溶性、極性小的物質(zhì)易通過擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞擴(kuò)散并不是微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要方式,水是唯一可以通擴(kuò)散自由

8、通過原生質(zhì)膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些氣體分子(O2、CO2)及某些氨基酸在一定程度上也可通過擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞。促進(jìn)擴(kuò)散易化擴(kuò)散是膜蛋白介導(dǎo)的被動(dòng)擴(kuò)散。物質(zhì)通過膜上的特殊蛋白質(zhì)（包括載體、通道）的介導(dǎo)、順電化學(xué)梯度的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要有兩種：一是經(jīng)載體介導(dǎo)的易化擴(kuò)散。二是經(jīng)通道介導(dǎo)的易化擴(kuò)散。單純擴(kuò)散與易化擴(kuò)散都屬于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要特點(diǎn)是：轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)過程的本身不需要消耗能量易化擴(kuò)散是膜蛋白介導(dǎo)的被動(dòng)擴(kuò)散。物質(zhì)通過膜上的特殊蛋白質(zhì)（包括載體、通道）的介導(dǎo)、順電化學(xué)梯度的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要有兩種：一是經(jīng)載體介導(dǎo)的易化擴(kuò)散。二是經(jīng)通道介導(dǎo)的易化擴(kuò)散。單純擴(kuò)散與易化擴(kuò)散

9、都屬于被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要特點(diǎn)是：轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)過程的本身不需要消耗能量，是在細(xì)胞膜上的特殊蛋白的“幫助”下，順著濃度梯度或電位梯度進(jìn)行的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，是一個(gè)“被動(dòng)”的過程。促進(jìn)擴(kuò)散同簡(jiǎn)單擴(kuò)散相比，具有以下一些特點(diǎn)： 促進(jìn)擴(kuò)散需要膜蛋白的幫助，并且比簡(jiǎn)單擴(kuò)散的速度要快幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 簡(jiǎn)單擴(kuò)散的速率與溶質(zhì)的濃度成正比，而膜蛋白幫助的促進(jìn)擴(kuò)散可以達(dá)到最大值，當(dāng)溶質(zhì)的跨膜濃度差達(dá)到一定程度時(shí)，促進(jìn)擴(kuò)散的速度不再提高。 在簡(jiǎn)單擴(kuò)散中，結(jié)構(gòu)上相似的分子以基本相同的速度通過膜，而在促進(jìn)擴(kuò)散中，運(yùn)輸?shù)鞍拙哂懈叨鹊倪x擇性。如運(yùn)輸?shù)鞍啄軌驇椭咸烟强焖龠\(yùn)輸，但不幫助與葡萄糖結(jié)構(gòu)類似的糖類運(yùn)輸。 與簡(jiǎn)單擴(kuò)散不同，運(yùn)輸?shù)鞍?/p>

10、的促進(jìn)擴(kuò)散作用也會(huì)受到各種抑制。膜運(yùn)輸?shù)鞍椎倪\(yùn)輸作用也會(huì)受到類似于酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，以及蛋白質(zhì)變性劑的抑制作用。主動(dòng)運(yùn)輸是指物質(zhì)逆濃度梯度，在載體的協(xié)助下，在能量的作用下運(yùn)進(jìn)或運(yùn)出細(xì)胞的過程。Na+、K+和Ca2+等離子，都不能自由地通過磷脂雙分子層，它們從低濃度一側(cè)運(yùn)輸?shù)礁邼舛纫粋?cè)，需要載體蛋白的協(xié)助，同時(shí)還需要消耗細(xì)胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)（主要為呼吸作用）所釋放的能量。鈉鉀泵實(shí)際上就是Na+-K+ATP酶，一般認(rèn)為是由2個(gè)大亞基、2個(gè)小亞基組成的4聚體。Na+-K+ATP酶通過磷酸化和去磷酸化過程發(fā)生構(gòu)象的變化，導(dǎo)致與Na+、K+的親和力發(fā)生變化。在膜內(nèi)側(cè)Na+與酶結(jié)合，激活A(yù)TP酶活性，使ATP分解

11、，酶被磷酸化，構(gòu)象發(fā)生變化，于是與Na+結(jié)合的部位轉(zhuǎn)向膜外側(cè)；這種磷酸化的酶對(duì)Na+的親和力低，對(duì)K+的親和力高，因而在膜外側(cè)釋放Na+、而與K+結(jié)合。K+與磷酸化酶結(jié)合后促使酶去磷酸化，酶的構(gòu)象恢復(fù)原狀，于是與K+結(jié)合的部位轉(zhuǎn)向膜內(nèi)側(cè)，K+與酶的親和力降低，使K+在膜內(nèi)被釋放，而又與Na+結(jié)合。其總的結(jié)果是每一循環(huán)消耗一個(gè)ATP；轉(zhuǎn)運(yùn)出三個(gè)Na+，轉(zhuǎn)進(jìn)兩個(gè)K+。鈉鉀泵的一個(gè)特性是他對(duì)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)依賴自磷酸化過程，ATP上的一個(gè)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到鈉鉀泵的一個(gè)天冬氨酸殘基上，導(dǎo)致構(gòu)象的變化。通過自磷酸化來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的離子泵就叫做P-type，與之相類似的還有鈣泵和質(zhì)子泵。它們組成了功能與結(jié)構(gòu)相似的一

12、個(gè)蛋白質(zhì)家族。Na+-K+泵作用是：維持細(xì)胞的滲透性，保持細(xì)胞的體積；維持低Na+高K+的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，維持細(xì)胞的靜息電位，同時(shí)也是動(dòng)作電位的基礎(chǔ)。烏本苷（ouabain）、地高辛（digoxin）等強(qiáng)心劑能抑制心肌細(xì)胞Na+-K+泵的活性；從而降低鈉鈣交換器效率，使內(nèi)流鈣離子增多，加強(qiáng)心肌收縮，因而具有強(qiáng)心作用。鈣離子泵鈣離子泵對(duì)于細(xì)胞是非常重要的，因?yàn)殁}離子通常與信號(hào)轉(zhuǎn)到有關(guān)，鈣離子濃度的變化會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的反應(yīng)，導(dǎo)致一系列的生理變化。通常細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（10-7M）顯著低于細(xì)胞外鈣離子濃度（10-3M），主要是因?yàn)橘|(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系，細(xì)胞內(nèi)鈣離子泵有兩類：其一是P型

13、離子泵，其原理與鈉鉀泵相似，每分解一個(gè)ATP分子，泵出2個(gè)Ca2+。另一類叫做鈉鈣交換器（Na+-Ca2+ exchanger），屬于反向協(xié)同運(yùn)輸體系（antiporter），通過鈉鈣交換來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子。位于肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum）上的鈣離子泵是了解最多的一類P型離子泵，占肌質(zhì)網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的90%。肌質(zhì)網(wǎng)是一類特化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)位于細(xì)胞質(zhì)中，具有貯存鈣離子的功能。肌細(xì)胞膜去極化后引起肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣離子通道打開，大量鈣離子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，引起肌肉收縮之后由鈣離子泵將鈣離子泵回肌質(zhì)網(wǎng)。質(zhì)子泵質(zhì)子泵有三類：P-type、V-type、F-type。1、P-type：載體

14、蛋白利用ATP使自身磷酸化（phosphorylation），發(fā)生構(gòu)象的改變來(lái)轉(zhuǎn)移質(zhì)子或其它離子，如植物細(xì)胞膜上的H+泵、動(dòng)物細(xì)胞的Na+ -K+泵、Ca2+離子泵，H+ -K+ATP酶（位于胃表皮細(xì)胞，分泌胃酸）。2、V-type：位于小泡（vacuole）的膜上，由許多亞基構(gòu)成，水解ATP產(chǎn)生能量，但不發(fā)生自磷酸化，位于溶酶體膜、動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)吞體、高爾基體的囊泡膜、植物液泡膜上。3、F-type：是由許多亞基構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)，H+沿濃度梯度運(yùn)動(dòng)，所釋放的能量與ATP合成耦聯(lián)起來(lái)，所以也叫ATP合酶（ATP synthase），F(xiàn)是氧化磷酸化或光合磷酸化偶聯(lián)因子（factor）的縮寫。F型質(zhì)子

15、泵位于細(xì)菌質(zhì)膜，線粒體內(nèi)膜和葉綠體的類囊體膜上。F型質(zhì)子泵不僅可以利用質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，也可以利用水解ATP釋放的能量轉(zhuǎn)移質(zhì)子。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)器ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器（ABC transporter）最早發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌，是細(xì)菌質(zhì)膜上的一種運(yùn)輸ATP酶（transport ATPase），屬于一個(gè)龐大而多樣的蛋白家族，每個(gè)成員都含有兩個(gè)高度保守的ATP結(jié)合區(qū)（ATP binding cassette），故名ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器，他們通過結(jié)合ATP發(fā)生二聚化，ATP水解后解聚，通過構(gòu)象的改變將與之結(jié)合的底物轉(zhuǎn)移至膜的另一側(cè)。在大腸桿菌中78個(gè)基因（占全部基因的5%）編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器蛋白，在動(dòng)物中可能更多。雖

16、然每一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器只轉(zhuǎn)運(yùn)一種或一類底物，但是其蛋白家族中具有能轉(zhuǎn)運(yùn)離子、氨基酸、核苷酸、多糖、多肽、甚至蛋白質(zhì)的成員。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器還可催化脂雙層的脂類在兩層之間翻轉(zhuǎn)，這在膜的發(fā)生和功能維護(hù)上具有重要的意義。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的真核細(xì)胞的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器是多藥抗性蛋白（multidrug resistance protein, MDR），該基因通常在肝癌患者的癌細(xì)胞中過表達(dá)，降低了化學(xué)治療的療效。約40%的患者的癌細(xì)胞內(nèi)該基因過度表達(dá)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器還與病原體對(duì)藥物的抗性有關(guān)，如臨床常用的抗真菌藥物有氟康唑、酮康唑、伊曲康唑等，真菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)重要機(jī)制是通過MDR蛋白降低了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度。

17、協(xié)同運(yùn)輸協(xié)同運(yùn)輸（cotransport）是一類靠間接提供能量完成的主動(dòng)運(yùn)輸方式。物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)所需要的能量來(lái)自膜兩側(cè)離子的電化學(xué)濃度梯度，而維持這種電化學(xué)勢(shì)的是鈉鉀泵或質(zhì)子泵。動(dòng)物細(xì)胞中常常利用膜兩側(cè)Na+濃度梯度來(lái)驅(qū)動(dòng)，植物細(xì)胞和細(xì)菌常利用H+濃度梯度來(lái)驅(qū)動(dòng)。根據(jù)物質(zhì)運(yùn)輸方向與離子沿濃度梯度的轉(zhuǎn)移方向，協(xié)同運(yùn)輸又可分為：同向協(xié)同（symport）與反向協(xié)同（antiport）。1、同向協(xié)同同向協(xié)同（symport）指物質(zhì)運(yùn)輸方向與離子轉(zhuǎn)移方向相同。如動(dòng)物小腸細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收就是伴隨著Na+的進(jìn)入，細(xì)胞內(nèi)的Na+離子又被鈉鉀泵泵出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)始終保持較低的鈉離子濃度，形成電化學(xué)梯度。在某些

18、細(xì)菌中，乳糖的吸收伴隨著H+的進(jìn)入，每轉(zhuǎn)移一個(gè)H+吸收一個(gè)乳糖分子。2、反向協(xié)同反向協(xié)同（antiport）物質(zhì)跨膜運(yùn)動(dòng)的方向與離子轉(zhuǎn)移的方向相反，如動(dòng)物細(xì)胞常通過Na+/H+反向協(xié)同運(yùn)輸?shù)姆绞絹?lái)轉(zhuǎn)運(yùn)H+以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的PH值，即Na+的進(jìn)入胞內(nèi)伴隨者H+的排出。此外質(zhì)子泵可直接利用ATP運(yùn)輸H+來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞PH值。還有一種機(jī)制是Na+驅(qū)動(dòng)的Cl-HCO3-交換，即Na+與HCO3-的進(jìn)入伴隨著Cl-和H+的外流，如紅細(xì)胞膜上的帶3蛋白。功能主動(dòng)運(yùn)輸這種物質(zhì)出入細(xì)胞的方式，能夠保證活細(xì)胞按照生命活動(dòng)的需要，主動(dòng)地選擇吸收所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，排出新陳代謝產(chǎn)生的廢物和對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)?？梢?，主動(dòng)運(yùn)輸對(duì)于

19、活細(xì)胞完成各項(xiàng)生命活動(dòng)有重要作用。維持細(xì)胞內(nèi)正常的生命活動(dòng),對(duì)神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞以及對(duì)維持細(xì)胞的滲透平衡,恒定細(xì)胞的體積都是非常重要的.主動(dòng)運(yùn)輸（active transport):質(zhì)膜上的載體蛋白將離子、營(yíng)養(yǎng)物和代謝物等逆電化學(xué)梯度從低濃度側(cè)向高濃度側(cè)的耗能運(yùn)輸。所耗能量由具ATP酶活性的膜蛋白分解ATP提供。例如正常生理?xiàng)l件下，人紅細(xì)胞內(nèi)K+的濃度相當(dāng)于血漿中的30倍，但K+仍能從血漿進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，Na+濃度比血漿中低很多，但Na+仍由紅細(xì)胞向血漿透出,呈現(xiàn)一種逆濃度梯度的“上坡”運(yùn)輸。差異有三個(gè)主要的差異：起始條件不同、運(yùn)輸方式不同、產(chǎn)生的結(jié)果不同。主動(dòng)運(yùn)輸消耗細(xì)胞代謝釋放的能量，被動(dòng)運(yùn)輸不

20、4.3選擇培養(yǎng)基的原則等。（一）配制培養(yǎng)基的4個(gè)原則1.目的明確 培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同； 例如枯草芽孢桿菌： 一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基； 自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基； 產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基； 根據(jù)不同的工作目的，微生物不同的營(yíng)養(yǎng)需要，運(yùn)用自己豐富的生物化學(xué)和微生物學(xué)知識(shí)來(lái)配制最佳的培養(yǎng)基。 2.營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào) 微生物細(xì)胞組成元素的調(diào)查或分析，是設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)的重要參考依據(jù)。 微生物細(xì)胞內(nèi)各種成分間有一較穩(wěn)定的比例。 在大多數(shù)化能異養(yǎng)菌的培養(yǎng)基中，各營(yíng)養(yǎng)要素間在量上的比例大體符合以下十倍序列的遞減規(guī)

21、律： 要素：H2OC源+能源 N 源 P、SK、Mg生長(zhǎng)因子 含量：(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)A.選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基： 細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡(jiǎn)稱普通肉湯培養(yǎng)基）； 放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)； 酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基； 霉菌：查氏合成培養(yǎng)基； 實(shí)驗(yàn)室一般培養(yǎng)：普通常用培養(yǎng)基； 遺傳研究：成分清楚的合成培養(yǎng)基； 生理、代謝研究：選用相應(yīng)的培養(yǎng)基配方； B.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度適宜, 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的配比適宜； 高濃度糖類物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，反而起 到抑制或殺

22、菌作用。培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長(zhǎng)繁殖和（或）代謝產(chǎn)物的形成和積累，其中碳氮比（CN）的影響較大。真菌需CN比較高的培養(yǎng)基；（素食） 細(xì)菌（動(dòng)物病原菌）需CN比較低的培養(yǎng)基；（葷食） 發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)： 碳氮比為4/1時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸積累少； 碳氮比為3/1時(shí)，菌體繁殖受到抑制，谷氨酸產(chǎn)量則大量增加。 NH3 CO(NH2)2 NH4NO3 (NH4)2CO3 (NH4)2SO4 含氮量（82）（46） （35） （29.2） （21） 這說明在同樣重量時(shí)，在以上各氮源中含氮量以氨為最高，尿素次之，硝酸銨和碳酸銨更次之，而硫酸銨則最低。 3.理化適宜 指培養(yǎng)

23、基的pH值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢(shì)等物理化學(xué)條件較為適宜。 包括：pH、滲透壓和水活度、氧化還原電位(1) pH 各大類微生物都有其生長(zhǎng)適宜的pH范圍，培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。 通常培養(yǎng)條件：（初始pH ） 細(xì)菌： pH 7.0-8.0 藻類： pH 6.0-7.0 酵母菌： pH 3.8-6.0 放線菌：pH 7.5-8.5 霉菌：pH 4.0-5.8 原生動(dòng)物： pH 6.0-8.0 嗜極菌（extremophiles） 在微生物的生長(zhǎng)、代謝過程中會(huì)產(chǎn)生引起培養(yǎng)基pH改變的代謝產(chǎn)物，為了維持培養(yǎng)基 pH的相對(duì)恒定，通常要進(jìn)行p

24、H的調(diào)節(jié)。 pH的調(diào)節(jié)包括pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)和pH的外源調(diào)節(jié)。 a.pH的內(nèi)源調(diào)節(jié):通過培養(yǎng)基內(nèi)在成分所起的調(diào)節(jié)作用，就是pH的內(nèi)源調(diào)節(jié)。 第一種是采用磷酸緩沖液進(jìn)行調(diào)節(jié)。 K2HPO4/KH2PO41時(shí)，溶液的pH穩(wěn)定在6.8。調(diào)節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者濃度比可獲得pH 6.07.6間的一系列穩(wěn)定的pH。 反應(yīng)原理：K2HPO4HClKH2PO4KCl KH2PO4KOHK2HPO4H2O 第二種以CaCO3作“備用堿”進(jìn)行調(diào)節(jié)。CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培養(yǎng)基中分布不均勻）、NaHCO3均可用來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。 反應(yīng)是：b.pH的外源調(diào)節(jié): 這是一類按實(shí)際需要不斷從外界流加

25、酸或堿液，以調(diào)整培養(yǎng)液的方法。(2) 滲透壓和水活度 滲透壓（osmotic pressure）是某水溶液中一個(gè)可用壓力來(lái)量度的一個(gè)物化指標(biāo)。 它表示兩種濃度不同的溶液間被一個(gè)半透性薄膜隔開時(shí)，稀溶液中的水分子會(huì)因水勢(shì)（water potentiality）的推動(dòng)而透過隔膜流向濃溶液，直到濃溶液產(chǎn)生的機(jī)械壓力足以使兩邊水分子的進(jìn)出達(dá)到平衡為止，這時(shí)由濃溶液中的溶質(zhì)所產(chǎn)生的機(jī)械壓力，即為它的滲透壓值。 與微生物細(xì)胞滲透壓相等的等滲溶液最適宜微生物的生長(zhǎng)； 高滲溶液會(huì)使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離； 低滲溶液則會(huì)使細(xì)胞吸水膨脹，形成很高的膨壓，這對(duì)細(xì)胞壁脆弱或喪失的各種缺壁細(xì)胞，例如原生質(zhì)體、球狀體或支原體來(lái)

26、說，則是致命的。 水活度即aw（wateractivity）是一個(gè)比滲透壓更有生理意義的一個(gè)物化指標(biāo)。它表示在天然或人為環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水的含量。各種微生物生長(zhǎng)繁殖范圍的aw值在0.9980.6之間：（3）氧化還原電勢(shì)（redox potential） 又稱氧化還原電位，是度量某氧化還原系統(tǒng)中還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢(shì)的一種指標(biāo)。 一般以Eh表示，它是指以氫電極為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)某氧化還原系統(tǒng)的電極電位值，單位是V（伏）或mV（毫伏）。不同類型微生物生長(zhǎng)對(duì)氧化還原電位的要求不同: 好氧性微生物：+0.1伏以上時(shí)可正常生長(zhǎng)，以+0.3+0.4伏為宜； 厭氧性微生物：低于+0.

27、1伏條件下生長(zhǎng)； 兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時(shí)進(jìn)行好氧呼吸，+0.1伏以下時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。氧化還原電位與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響: 增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓，或加入氧化劑，從而增加Eh值在培養(yǎng)基 中加入巰基乙醇、抗壞血酸（Vc，0.1%）、硫化氫(0.025%)、半胱氨酸（0.05%）、谷胱甘肽、鐵 屑、二硫蘇糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等還原性物質(zhì)可降低Eh值。 測(cè)定氧化還原電勢(shì)除用電位計(jì)外，還可在培養(yǎng)基中加入化學(xué)指示劑刃天青（resazurin） 進(jìn)行間接測(cè)定 刃天青在無(wú)氧條件下呈無(wú)色（Eh-40 mV）；在有氧條件下，其顏色與溶液的pH相關(guān)；（中性

28、紫色；堿性藍(lán)色；酸性紅色）；在微量氧時(shí)，它呈粉紅色。 4.經(jīng)濟(jì)節(jié)約 配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)盡量利用廉價(jià)且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成份,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,以降低生產(chǎn)成本。 (1)以粗代精：對(duì)微生物來(lái)說，各種粗原料營(yíng)養(yǎng)更加完全，效果更好。而且在經(jīng)濟(jì)上也節(jié)約。大量的農(nóng)副產(chǎn)品或制品，如麩皮、米糠、玉米漿、酵母浸膏、酒糟、豆餅、花生餅、蛋白胨等都是常用的發(fā)酵工業(yè)原料。 (2)以“野”代“家”： 以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉質(zhì)的野生植物，可以部分取代糧食用于工業(yè)發(fā)酵的碳源。 (3)以廢代好：以工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中易污染環(huán)境的廢棄物作為培養(yǎng)微生物的原料。 例如，糖蜜(制糖工業(yè)中含有蔗糖

29、的廢液)、乳清(乳制品工業(yè)中含有乳糖的廢液)、 豆制品工業(yè)廢液、黑廢液(造紙工業(yè)中含有戊糖和己糖的亞硫酸紙漿)等。 工業(yè)上的甲烷發(fā)酵主要利用廢水、廢渣作原料,在我國(guó)農(nóng)村，已推廣利用糞便及禾草為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲烷作為燃料。 (4)以簡(jiǎn)代繁：某制藥廠改進(jìn)鏈霉素發(fā)酵液中的原有配方，設(shè)法減去30-50%的黃豆餅粉、25%的葡萄糖和20%硫酸銨，結(jié)果反而提高了產(chǎn)量。 (5)以氮代朊：以大氣氮、銨鹽、硝酸鹽或尿素等一類非蛋白質(zhì)或非氨基酸廉價(jià)原料用作發(fā)酵培養(yǎng)基的原料，讓微生物轉(zhuǎn)化成菌體蛋白質(zhì)或含氮的發(fā)酵產(chǎn)物供人們利用。 (6)以纖代糖：開發(fā)利用纖維素這種世界上含量最豐富的可再生資源。將大量的纖維素農(nóng)副產(chǎn)品轉(zhuǎn)變

30、為優(yōu)質(zhì)飼料、工業(yè)發(fā)酵原料、燃料及人類的食品及飲料。 (7)以“國(guó)”代“進(jìn)”： 以國(guó)產(chǎn)原料代替進(jìn)口原料，盡量減少工業(yè)成本。國(guó)內(nèi)青霉素發(fā)酵工業(yè)的迅速發(fā)展，依賴于找到了富有中國(guó)特色的培養(yǎng)基配方，即用廉價(jià)的棉子餅（或花生餅）和白玉米粉代替玉米漿和乳糖。 五、實(shí)驗(yàn)藥品及儀器天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3g 蛋白胨 5g 氯化鈉 10g 瓊脂520g pH 7.0-7.2 水 1000mL

31、 甘露醇瓊脂酵母膏5g 蛋白胨 3g 甘露醇25g 瓊脂15g 蒸餾水 1000ml 7.5%氯化鈉肉湯蛋白胨 10.0g 牛肉浸粉 5.0g 氯化鈉 75.0g pH值7.40.1 25 Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)（鑒別）蛋白胨10.0g 牛肉浸粉5.0g 酵母浸粉1.0g 丙酮酸鈉10.0g 氯化鋰5.0g 瓊脂15.0g pH值7.00.225 甘氨酸12.0g用法稱取本品58.0g,加熱攪拌溶解于950ml蒸餾水中,分裝每瓶95ml,121高壓滅菌15分鐘,臨用前加熱溶化瓊脂,冷至50左右,于每95ml培養(yǎng)基中加入常溫解凍的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5ml搖勻后傾入無(wú)菌平皿。使用前在冰箱

32、貯存不得超過48h。質(zhì)量控制和典型特征在361培養(yǎng)45-48h,金黃色葡萄球菌的單個(gè)菌落呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤(rùn),直徑2-3mm。灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色（非白色）的邊緣,周圍繞以不透明圈（沉淀）,其外常有一清晰帶。添加劑亞碲酸鹽卵黃增菌液用法稱取本品90.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝三角瓶或試管,121高壓滅菌15分鐘,備用。Baird-Parker培養(yǎng)基在含有氮源的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的丙酮酸鈉，又含有抑制劑：亞碲酸鉀，故有較好的選擇性。但對(duì)于金葡萄球菌沒有抑制，其能將亞碲酸鉀還原為碲在菌落中心呈黑色，易于觀察；加入卵黃，由于卵磷酯酶陽(yáng)性特征，其菌落周圍可出現(xiàn)

33、明顯的沉淀環(huán)。 利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行常見致病菌的分離是致病菌檢測(cè)中的重要部分。六、實(shí)驗(yàn)步驟6.1 培養(yǎng)基的制備6.1.1 稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。6.1.2 溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。6.1.3 調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至

34、所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。6.1.4 溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。6.1.5 過濾分裝 分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。6.1.6 包扎標(biāo)記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日

35、期等。6.1.7 滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為12120min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長(zhǎng)度一般以不超過試管長(zhǎng)度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。6.1.8 倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到4550,立刻倒平板。其過程是：在酒精燈火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰，目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養(yǎng)基；左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，立刻蓋上皿蓋。待平板冷卻凝固后，將平板倒過來(lái)放置，目

36、的是防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。6.2、滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi) 蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。6.2.1 濕熱滅菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對(duì)于細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體煮沸約1530min，對(duì)于芽孢則需煮沸約12h。高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2