1、,第二十五章 移植免疫與免疫學(xué)檢測,概 述,1.移植的概念 當(dāng)細(xì)胞、組織或器官從一個(gè)個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)個(gè)體，或從同一個(gè)個(gè)體的一個(gè)部位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)部位，并且在新的個(gè)體體內(nèi)，或新的部位發(fā)揮這些細(xì)胞、組織或器官的功能稱為移植。,2. 移植的應(yīng)用 1）當(dāng)患者的器官或組織因各種原因?qū)е缕涔δ軉适?，一般治療手段難以挽救； 2）器官或組織發(fā)生癌變，需要進(jìn)行根治性切除或損毀，但切除或損毀后剩余器官或組織的功能不能滿足機(jī)體的需要； 3）血液造血或免疫系統(tǒng)的腫瘤或嚴(yán)重的自身免疫性疾病，采取措施摧毀患者的造血系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)，然后靠移植進(jìn)行重建。,3.移植免疫相關(guān)的重要術(shù)語 供者：提供器官、組織或細(xì)胞的個(gè)體。 受者：接

2、受的個(gè)體。 移植物：被移植的器官、組織或細(xì)胞。,自體移植：供者和受者為同一個(gè)體，若移植物植于原解剖位置稱為再植，如斷肢再植。 同質(zhì)移植: 供者與受者雖非同一個(gè)個(gè)體，但抗原結(jié)構(gòu)完全相同，如同卵雙生子之間的移植，純系動物之間的移植。,同種（異體）移植: 供者與受者屬于同一種族但不同個(gè)體，在動物實(shí)驗(yàn)中一般指同一種族但不同純系動物之間的移植。 異種移植: 供者與受者系不同的種族。 活體移植：移植物來源于活體供者。 尸體移植: 移植物來源于腦死亡但血液循環(huán)健全，或心臟停止跳動后立即取出的供者。,第一節(jié) 引起排斥反應(yīng)的靶抗原,一、主要組織相容性抗原,移植抗原: 主要組織相容性復(fù)合體（MHC）編碼的人類白細(xì)

3、胞抗原（HLA），是不同個(gè)體間進(jìn)行器官或組織細(xì)胞移植時(shí)發(fā)生排斥反應(yīng)的主要成分，這種代表個(gè)體特異性的同種抗原又稱組織相容性抗原或移植抗原。,HLA復(fù)合體定位在第6號染色體短臂6p21.31，是調(diào)控人體特異性應(yīng)答和決定疾病易感性個(gè)體差異的主要基因系統(tǒng)，基因片段長度約4cM或3600kb，占人體整個(gè)基因組的13000。,參與抗原加工與呈遞,內(nèi)源性抗原肽HLA CD8+T細(xì)胞 外源性抗原肽HLA CD4+T細(xì)胞,經(jīng)典MHC基因及其產(chǎn)物的生物學(xué)功能是呈遞抗原肽供T細(xì)胞識別，進(jìn)而激活T細(xì)胞。 但在器官移植免疫中，這功能部分地轉(zhuǎn)化為非己成分對機(jī)體免疫系統(tǒng)的激發(fā)，使之排斥帶有這些非已成分的移植物。,MHC多態(tài)

4、性,高等動物的主要組織相容性基因復(fù)合體整體結(jié)構(gòu)上具有相似性和可比性，但也存在大量變異。 多態(tài)性指一個(gè)基因座位上存在3個(gè)以上的等位基因。 有可能一個(gè)MHC基因座位上等位基因結(jié)構(gòu)的微小變化，甚至12個(gè)氨基酸殘基的不同，會引發(fā)移植物排斥反應(yīng)。,人體MHC(稱為HLA)共224個(gè)基因座位，其中128個(gè)為功能性基因。 截至2005年7月，檢測到等位基因數(shù)已達(dá)3032個(gè)，其中多態(tài)性最豐富的兩個(gè)座位HLA-B和HLA-DRBl，等位基因數(shù)分別為700和403。 因而，通過多基因座位不同等位基因的排列與組合，兩個(gè)個(gè)體間，除了同卵雙生者，HLA位基因全部相同的機(jī)會幾乎等于零。,現(xiàn)今確認(rèn)顯示多態(tài)性的基因系統(tǒng)已不限

5、于MHC，至少還有部分細(xì)胞因子受體編碼基因、Fc受體編碼基因、趨化因子受體編碼基因、次要組織相容性抗原等。,為什么器官移植時(shí)MHC是最需要關(guān)注的移植抗原？,第一，它們的多態(tài)性變異幅度遠(yuǎn)不如MHC。 第二，MHC-I類抗原表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面，類抗原表達(dá)于激活后的APC和T細(xì)胞，這一組織分布特點(diǎn)決定了MHC幾乎是無處不在地顯示其功能和抗原特性。,第三，MHC分子通過呈遞抗原肽，在數(shù)量極大的T細(xì)胞庫中選擇并激活特異性T細(xì)胞克隆，啟動高效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答和高度特異性的移植物排斥反應(yīng)。說明供者來源的非己MHC分子屬于最重要的移植抗原。,正是MHC的重要性和豐富的多態(tài)性，成為器官移植最需要關(guān)注的移植抗

6、原。 MHC多態(tài)性越豐富，其產(chǎn)物作為非己抗原的免疫原性就越強(qiáng)，群體中搜尋遺傳背景完全相同的供受者就越困難。,二、次要組織相容性抗原,常見的mHA ：Y染色體上的 H-Y抗原 線粒體蛋白 病毒蛋白多肽 mHA是相對MHA或HLA而言的，究竟系哪些基因編碼尚無定論。 mHA在某些組織或器官移植時(shí)同樣發(fā)揮重要作用，特別是骨髓移植。,三、ABO血型抗原系統(tǒng),ABO血型抗原具有極為廣泛的組織分布，幾乎所有人體組織器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均含有此類抗原。 在進(jìn)行器官移植時(shí)，應(yīng)力求供、受體間ABO血型的一致。,四、組織特異性抗原,組織特異性抗原，是一類特異性地表達(dá)于各種器官、組織、細(xì)胞上的抗原系統(tǒng)。 此類抗原

7、在移植排斥反應(yīng)中的作用越來越受到人們的重視，然而對其研究的深度遠(yuǎn)不如HLA。,目前，已被關(guān)注的組織特異性抗原有：血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原、腎特異性抗原、肝臟特異性抗原、胰腺特異性抗原、心臟特異性抗原、骨髓特異性抗原和皮膚特異性抗原等。,第二節(jié) 移植排斥反應(yīng)的種類及發(fā)生機(jī)制,宿主抗移植物排斥(hostversus-graft rejection，HVGR) 移植物抗宿主排斥(graftversus-host rejection，GVHR),宿主抗移植物排斥(HVGR) 超急性排斥(hyperacute rejection) 急性排斥(acute rejection) 慢性排斥(chronic re

8、jection。 移植物抗宿主排斥GVHR 急性GVHR 慢性GVHR,一、宿主抗移植物反應(yīng),（一）超急性排斥反應(yīng),1 概念 超急性排斥反應(yīng)，又稱抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，指移植物在恢復(fù)血供后幾分鐘到數(shù)小時(shí)之內(nèi)發(fā)生的不可逆的體液排斥反應(yīng)。,1)經(jīng)典超急性排斥反應(yīng) 發(fā)生于移植后24 h以內(nèi),由于發(fā)生時(shí)間早，故較常見于手術(shù)中。其肉眼觀表現(xiàn)為恢復(fù)血供后，移植物顏色由正常逐漸變?yōu)榘导t、青紫，質(zhì)地變軟，體積增大，同時(shí)伴隨功能喪失。由于無有效治療措施，如發(fā)生于手術(shù)中，往往立即摘除移植物。,2）延遲超急性排斥反應(yīng) 發(fā)生于移植術(shù)后2448 h內(nèi)者，受者表現(xiàn)術(shù)后高熱、寒戰(zhàn)、移植區(qū)劇烈疼痛、移植物功能喪失，被迫再次手術(shù)

9、摘除移植物。,2 機(jī)制 與受者體內(nèi)預(yù)存的抗供者組織抗原的抗體有關(guān)，即由型超敏反應(yīng)引起。首先抗體與移植物血管內(nèi)皮抗原結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活化，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)。,3 病理學(xué)變化 這些級聯(lián)反應(yīng)使血管通透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促使血管內(nèi)血小板和中性粒細(xì)胞聚集，纖維蛋白沉積，引起廣泛血管內(nèi)凝血和血栓形成，造成組織缺血和廣泛梗死，最終導(dǎo)致移植物功能迅速喪失。,（二）急性排斥反應(yīng),1 概念 急性排斥(acute rejection)是最常見的排斥類型。一般在移植后數(shù)天到幾個(gè)月內(nèi)發(fā)生，進(jìn)展迅速，術(shù)后3個(gè)月強(qiáng)度逐漸減弱，但術(shù)后1年內(nèi)常反復(fù)出現(xiàn)。,臨床表現(xiàn)： 突發(fā)寒戰(zhàn)、高熱，局部脹痛，移植物腫大、功能減退，如

10、肝移植表現(xiàn)為黃疸明顯加深，血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素快速上升；腎移植表現(xiàn)為尿量減少，血肌酐和尿素氮增高；胰腺移植首先表現(xiàn)為外分泌功能減退，然后血糖增高。,2 機(jī)制 目前研究表明，細(xì)胞免疫和體液免疫均參與了急性排斥反應(yīng)。細(xì)胞免疫的中心環(huán)節(jié)是CD4+T淋巴細(xì)胞的激活。一般要經(jīng)歷三個(gè)過程：抗原呈遞；T細(xì)胞激活、增殖和分化；效應(yīng)階段。,(1)抗原呈遞 直接途徑 間接途徑,T細(xì)胞對非已MHC抗原識別的兩種途徑,返回,(2)效應(yīng)階段 活化的Th1細(xì)胞和CTL在趨化因子作用下，遷移到移植物局部，損傷移植物。,3 . 病理學(xué)改變 1)炎性浸潤: 以單核細(xì)胞為主，此外還有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞。 2)

11、血管炎: 主要是中、小血管受累，尤其是中、小動脈為主的血管內(nèi)膜炎。,(三)慢性排斥反應(yīng),1.概念 慢性排斥多發(fā)生于移植6-12個(gè)月以后，病程進(jìn)展緩慢，常呈隱匿性，表現(xiàn)為移植物功能進(jìn)行性喪失。,2 機(jī)制 慢性排斥反應(yīng)的發(fā)病學(xué)機(jī)制比較復(fù)雜，是移植物對損傷的綜合反應(yīng)，為免疫和非免疫機(jī)制共同作用的多因素、多步驟過程。,3 病理變化 病理變化主要特征為增生，表現(xiàn)為移植物持續(xù)性血管周圍炎癥反應(yīng)，廣泛的中心性動脈間質(zhì)纖維化。移植物局部缺血、壞死、纖維化。,二、 移植物抗宿主反應(yīng),1.概述,移植物抗宿主排斥(Graft Versus Host Rejection，GVHR)是移植物中的免疫活性細(xì)胞識別宿主組織

12、，并發(fā)起免疫攻擊，導(dǎo)致宿主器官組織損傷的一種免疫反應(yīng)，亦稱移植物抗宿主病。,常見于骨髓移植，胸腺、小腸和肝移植等富含淋巴細(xì)胞的器官移植，免疫缺陷的新生兒或使用免疫抑制劑的個(gè)體接受大量輸血時(shí)也可見到。,2.機(jī)制,來自移植物中的供者源性免疫細(xì)胞，被受者異型組織相容性抗原激活，增殖分化成效應(yīng)細(xì)胞，并隨血液在受者體內(nèi)移動，對宿主的組織器官發(fā)起攻擊，導(dǎo)致組織器官損傷。,急性GVHD：最早發(fā)生于移植后1周，常見于34周，最晚在3個(gè)月內(nèi)。 慢性GVHD：多發(fā)生于移植后3個(gè)月，表現(xiàn)為受累器官功能進(jìn)行性喪失，病理變化為器官的萎縮和纖維化。,第三節(jié) HLA分型技術(shù),一、HLA抗原血清學(xué)分型技術(shù),（一）基本原理,H

13、LA細(xì)胞毒抗體屬于免疫球蛋白IgG和IgM類型的抗體。 此抗體在補(bǔ)體存在的情況下，能夠結(jié)合到帶有相應(yīng)抗原的活淋巴細(xì)胞膜表面上，并在膜上打洞。 細(xì)胞膜被破壞了的死淋巴細(xì)胞，采用染色法，染料進(jìn)入死細(xì)胞后使死細(xì)胞體積增大并著色，活細(xì)胞不被著色。 一般根據(jù)死亡細(xì)胞占全部檢測細(xì)胞的百分比的試驗(yàn)結(jié)果，來判斷抗體與抗原反應(yīng)的強(qiáng)度。,微量細(xì)胞毒試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn),用于HLA分型的微量細(xì)胞毒試驗(yàn),HLA分型結(jié)果舉例,二、HLA抗原細(xì)胞學(xué)分型技術(shù),混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法(mixed lymphocyte culture，簡稱MLC),（一）單向MLC方法,將已知HLA型別的分型細(xì)胞事先用絲裂霉素C或X線照射使其失去應(yīng)答能

14、力，仍保持刺激能力，這種淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞； 而以具有增殖能力的受檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞。 將這兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，反應(yīng)細(xì)胞可對刺激細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答面增殖，從而判斷受檢細(xì)胞的HLA型別。 根據(jù)選用的刺激細(xì)胞類型，可將單向MLC分為陽性和陰性分型法。,（二）雙向MLC方法,雙向MLC是直接把未經(jīng)任何處理的兩個(gè)個(gè)體的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，如果它們的HLA-D抗原相同，則相互刺激作用很小，細(xì)胞無變化； 反之，如雙方HLA-D抗原不相容，則相互刺激作用就大，細(xì)胞被活化并產(chǎn)生增殖，增殖的程度與兩個(gè)體的HLA-D抗原不配合程度成正比。 本法不能判斷型別，可做配型試驗(yàn)。,三、DNA分型技術(shù),發(fā)展歷史,19

15、64年Terasaki發(fā)明了HLA微量淋巴細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法(microlymphocvtotoxicity test)及相應(yīng)的組織配型板，并于1970年被美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)確定為國際通用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。HLA的血清學(xué)研究得到了迅速發(fā)展。 進(jìn)入80年代后期，分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展與成熟， 90年代初期，HLA的研究進(jìn)入了DNA分型研究階段。 經(jīng)過近30年的國際合作研究，HLA血清學(xué)研究大體告一段落，全面轉(zhuǎn)入DNA分型研究。,(一) 限制性片段長度多態(tài)性分析,基本原理,根據(jù)HLA核苷酸堿基序列，在不同部位存在多個(gè)不同的酶切位點(diǎn)。 由于不同等位基因堿基序列的不同和限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)分布不同，使

16、限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)和酶切點(diǎn)數(shù)目改變，因此，產(chǎn)生了數(shù)量和長度均不同的酶切片段，出現(xiàn)了不同的DNA條帶型。 由此，可鑒定HLA基因的特異性。,PCR-RFLP：采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化切割，直接在電泳上進(jìn)行RFLP分析，大大提高了目的DNA含量和相對特異性，使臨床應(yīng)用更為方便。,（二）聚合酶鏈反應(yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP),原理: 在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，單鏈DNA形成一定的空間結(jié)構(gòu)，具有一定的構(gòu)象。相同長度的單鏈DNA因其堿基順序不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳時(shí)泳動速度和遷移率也不相同。 通過PCR擴(kuò)增，變性后進(jìn)行SSCP分析。 因此，供受者的SSCP帶型一致者，其HLA基因相匹配，而電泳帶型出現(xiàn)差異者，則不匹配。,(三)