1、鎳柱親和色譜親和層析的原理：利用分子間的特定相互作用，它們可以特異性地可逆結(jié)合，這種結(jié)合力稱為親和力。具有特定親和力的普通生物分子對(duì)：酶：基質(zhì)類似物、抑制劑、輔酶抗體：抗原、病毒、細(xì)胞細(xì)胞：細(xì)胞表面特異性蛋白，凝集素核酸：互補(bǔ)堿基序列，組蛋白，核酸聚合酶激素或藥物：受體，載體蛋白外源凝集素：多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體、細(xì)胞在文獻(xiàn)中，固定在色譜基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成親和色譜的固定相，稱為親和吸附劑。配體通過共價(jià)鍵與活化的基質(zhì)結(jié)合形成固體載體。一般載體有瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和纖維素。咪唑環(huán)：是1，3-二氮雜環(huán)，英文名稱是咪唑。如果氫原子的剩余部分從第一個(gè)或第

2、三個(gè)氮原子上被除去，它被稱為咪唑基。它是咪唑的一部分，在除去與氮原子直接相連的氫原子后留下組氨酸的性質(zhì)：疏水性弱，咪唑環(huán)為弱電。金屬離子：過渡金屬離子如Cu2、Ni2、Zn2和Co2能與電源原子如氮、硫和氧產(chǎn)生配位鍵，因此它們能與蛋白質(zhì)表面組氨酸的咪唑基(His)、半胱氨酸的巰基(Cys)和色氨酸的吲哚基(Trp)發(fā)生親和結(jié)合，其中His的咪唑基具有最強(qiáng)的結(jié)合作用。過渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強(qiáng)度大小順序?yàn)镃u2 Ni2 Zn2 Co2。鎳離子：有六個(gè)螯合價(jià)格點(diǎn)，鎳柱通常分為鎳-NTA和鎳-伊達(dá)。鎳-NTA螯合物是四價(jià)的，仍然是二價(jià)的。而鎳-IDA螯合三價(jià)，留下三價(jià)。因此，鎳-IDA瓊脂糖的結(jié)合

3、力比鎳-NTA瓊脂糖強(qiáng)。在相同條件下，鎳-IDA瓊脂糖的負(fù)載量高于鎳-NTA瓊脂糖，用于洗脫雜質(zhì)和靶蛋白的緩沖液中咪唑的濃度較高。然而，鎳-NTA更穩(wěn)定，對(duì)還原劑更有抵抗力，鎳離子不太可能脫落。因此，有必要根據(jù)不同的凈化條件選擇鎳柱進(jìn)行凈化，以達(dá)到最佳的凈化效果。矩陣：不溶性多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，滲透性好；物理化學(xué)穩(wěn)定性高，機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長(zhǎng)；(3)抗微生物和酶的侵蝕；優(yōu)選粒徑均勻的球形顆粒；親水性和非特異性吸附；含有可活化的活性基團(tuán)，有利于親和配體的固定化。實(shí)例：瓊脂糖凝膠微球的商品名是瓊脂糖凝膠，當(dāng)糖含量分別為2%、4%和6%時(shí)，稱為2B、4B和6B。瓊脂糖4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，吸附容量比2B

4、大，因此4B被廣泛使用。配體：一種能可逆結(jié)合特定分子或基團(tuán)的分子，可通過親和層析純化。配體的選擇受兩個(gè)因素的影響：(1)配體和靶之間的結(jié)合必須是特異性的和可逆的。(2):它必須有化學(xué)修飾基團(tuán)，這樣它才能被吸附在基質(zhì)上而不破壞其活性。間隔臂：靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于分子的深處。如果配體直接偶聯(lián)到底物上，由于空間位阻，配體不能到達(dá)靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，因此與靶蛋白的結(jié)合能力低。因此，在配體和基質(zhì)之間插入間隔臂可以使結(jié)合更容易。間隔臂使結(jié)合最大化，同時(shí)避免非特異性結(jié)合。間隔臂的長(zhǎng)度是關(guān)鍵，太短且無效；時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合。一般規(guī)則：當(dāng)偶聯(lián)的分子量小于1000時(shí)使用間隔臂；當(dāng)分子量大時(shí)，這是不必要的。

5、二硫鍵：蛋白質(zhì)的二硫鍵形成于半胱氨酸殘基的硫醇之間。二硫鍵通常在內(nèi)含蛋白離開細(xì)胞后以氧化態(tài)存在。這個(gè)鍵在蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的形成中起著重要的作用。為了確定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，二硫鍵必須打開以形成一條線性多肽鏈。抽樣方法：(1)直接抽樣(2)間接抽樣洗脫方法：(1)酸堿度洗脫：酸堿度的改變可以改變帶電配體基團(tuán)和結(jié)合蛋白的電離度，降低其結(jié)合位點(diǎn)的親和力。(降低酸堿度的方法)(2)離子強(qiáng)度洗脫：(3)競(jìng)爭(zhēng)性洗脫：(咪唑)再生：(1)用強(qiáng)變性劑6M鹽酸胍洗滌柱(2)用水沖洗干凈(3)用0.2% SDS沖洗色譜柱(4)用水沖洗干凈(5)用50%乙醇洗滌柱(6)用水沖洗干凈(7)用100毫米乙二胺四乙酸(5

6、0毫米Tris 100毫米乙二胺四乙酸，pH 8.0)沖洗色譜柱(8)用水沖洗干凈(9)用100毫米硫酸鎳孵育色譜柱(10)儲(chǔ)存在4的20%乙醇中上清液緩沖液和配方上清液純化緩沖液公式裂解緩沖液50毫米三鹽酸；150毫米氯化鈉；20毫米咪唑；pH8.0洗脫緩沖液150毫米三鹽酸；150毫米氯化鈉；50毫米咪唑；pH8.0洗脫緩沖液250毫米三鹽酸；150毫米氯化鈉；100毫米咪唑；pH8.0洗脫緩沖液350毫米三鹽酸；150毫米氯化鈉；300毫米咪唑；pH8.0包涵體緩沖溶液及配方包涵體純化緩沖液公式IB裂解緩沖液120毫米Tris150毫米氯化鈉；2mM乙二胺四乙酸；2mMDTT1%海衛(wèi)一X

7、-100；PH8.0裂解緩沖液250毫米三鹽酸；150毫米氯化鈉；8尿素；pH8.0IB洗脫緩沖液150毫米三鹽酸；150毫納克。20分鐘左右；8尿素；pH8.0IB洗脫緩沖液250毫米三鹽酸；150毫納克。50毫米左拉；8尿素；pH8.0IB洗脫緩沖液350毫米三鹽酸；150毫納克。100毫米左拉；8尿素；pH8.0IB洗脫緩沖液450毫米三鹽酸；150毫納克。300毫米左拉；8尿素；pH8.0IB洗脫緩沖液550毫米三鹽酸；150毫納克。500毫米左拉；8尿素；pH8.0試劑及其功能1.TritonX -100 (triton x-100)具有親水端和疏水端，能從細(xì)胞膜上解離膜蛋白以提取膜

8、蛋白。常用的非離子洗滌劑。用途：1%-3%TritonX -100。2.TCEP (tris (2-羧乙基)膦)是一種非常有效的硫醇還原劑，在蛋白質(zhì)化學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中廣泛用作二硫鍵的定量還原劑。該試劑在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性和溶解性。在酸性和堿性溶液中的穩(wěn)定性也很好。與DTT等硫醇還原劑相比，TCEP不僅是一種高效的二硫鍵還原劑，而且在一些巰基交聯(lián)反應(yīng)中也不需要除去。劑量：1毫米/毫升。3.胃蛋白酶抑制劑：能抑制酸性蛋白酶，溶于甲醇，不溶于水。劑量：1微克/毫升。儲(chǔ)存在：-4(一周)/-20(半年)。4.亮肽素：它能抑制絲氨酸和巰基蛋白酶，在制備過程中溶于水。劑量為1微克/毫升。儲(chǔ)存在：

9、-4(一周)/-20(半年)。5.乙二胺四乙酸：螯合劑，可消除痕量重金屬對(duì)酶催化反應(yīng)的抑制。干擾金屬離子可以在不影響蛋白質(zhì)功能的情況下被去除，但同時(shí)金屬蛋白酶的活性可能會(huì)喪失。劑量：0.1-5毫摩爾/升6.甘油：增加粘度，減少分子間碰撞，用量：5%-30%。7.十二烷基硫酸鈉：能使蛋白質(zhì)變性的陰離子洗滌劑，用量：0.1%-1%。8.TritonX -114:當(dāng)溫度高于22時(shí)，在蛋白質(zhì)溶液中加入2%的TritonX -114可以將蛋白質(zhì)從洗滌劑相和液相中分離出來，而可溶性蛋白質(zhì)處于液相，膜蛋白進(jìn)入洗滌劑相。(內(nèi)毒素存在于細(xì)胞壁成分中，在細(xì)菌裂解后釋放出來。)9.二硫蘇糖醇：通常用于減少蛋白質(zhì)中的二硫鍵，并可用于防止蛋白質(zhì)中半胱氨酸之間形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵。然而，DTT通常不能減少蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)