1、DNA重組及重組DNA技術(shù),生物化學(xué)與分子生物學(xué),DNA重組及重組DNA技術(shù),DNA重組和重組DNA技術(shù) DNA Recombination and Recombinant DNA technology,第二十一章,DNA重組及重組DNA技術(shù),DNA重組（DNA recombination）是指不同DNA分子斷裂和連接而產(chǎn)生DNA片段的交換并重新組合形成新DNA分子的過(guò)程。 重組DNA技術(shù)（recombinant DNA technology）是指在體外將兩個(gè)或兩個(gè)以上DNA分子重新組合并在適當(dāng)細(xì)胞中增殖形成新DNA分子的過(guò)程。,DNA重組及重組DNA技術(shù),第一節(jié) 自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移

2、DNA Recombination and Gene Transfer in Nature,DNA重組及重組DNA技術(shù),DNA重組,同源重組 (homologous recombination) 位點(diǎn)特異的重組(site-specific recombination) 轉(zhuǎn)座重組(transposition recombination) 接合作用 (conjugation) 轉(zhuǎn)化作用 (transformation) 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 (transduction),DNA重組及重組DNA技術(shù),發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組（gener

3、al recombination）。是最基本的DNA重組方式，通過(guò)鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型,一、同源重組是最基本的DNA重組方式,DNA重組及重組DNA技術(shù),Holliday模型的4個(gè)關(guān)鍵步驟：,兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊；,一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體；,通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA；,Holliday中間體切開(kāi)并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：,DNA重組及重組DNA技術(shù),片段重組體 切開(kāi)的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條

4、鏈，重組 體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。,拼接重組體 切開(kāi)的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。,DNA重組及重組DNA技術(shù),參與細(xì)菌DNA同源重組的酶有數(shù)十種，其中最關(guān)鍵的是RecA蛋白、RecBCD復(fù)合物和RuvC蛋白。 RecBCD復(fù)合物具有三種酶活性，即依賴于ATP的核酸外切酶活性、可被ATP增強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。 RecA蛋白可結(jié)合單鏈DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA復(fù)合物。 RuvC有內(nèi)切酶活性，能專一性識(shí)別Holliday連接點(diǎn)，并有選擇地切開(kāi)同源重組體的中間體。,DNA重組及重組DNA技術(shù),H

5、olliday中間體,DNA重組及重組DNA技術(shù),5,拼接重組體,片段重組體,DNA重組及重組DNA技術(shù),二、位點(diǎn)特異重組是發(fā)生在特異位點(diǎn)間的DNA整合,位點(diǎn)特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。,DNA重組及重組DNA技術(shù),噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。,（一）噬菌體DNA的整合,DNA重組及重組DNA技術(shù),（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組,沙門氏菌H片段倒位

6、決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。,DNA重組及重組DNA技術(shù),hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。,DNA重組及重組DNA技術(shù),沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變,DNA重組及重組DNA技術(shù),（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個(gè)獨(dú)立的基因族編碼，其中兩個(gè)編碼輕鏈(和)，一個(gè)編碼重鏈。,輕鏈的基因片段：,重鏈的基因片段：,DNA重組及重組DNA技術(shù),重鏈(IgH)

7、基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點(diǎn)上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號(hào)序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個(gè)，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。,DNA重組及重組DNA技術(shù),免疫球蛋白基因重排過(guò)程,DNA重組及重組DNA技術(shù),三、轉(zhuǎn)座重組可使基因移位,由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。,大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到

8、另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列包括插入序列和轉(zhuǎn)座子。,DNA重組及重組DNA技術(shù),插入序列(insertion sequences, IS)組成：,（一）插入序列轉(zhuǎn)座,二個(gè)分離的反向重復(fù)(inverted repeats, IR)序列,特有的正向重復(fù)序列,一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因,DNA重組及重組DNA技術(shù),插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：,保守性轉(zhuǎn)座(conservative transposition),復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicative transposition),DNA重組及重組DNA技術(shù),插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座,DNA重組及重組DNA技術(shù),轉(zhuǎn)座子(transposons

9、) 可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。,（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座,轉(zhuǎn)座子組成：,反向重復(fù)序列 轉(zhuǎn)座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因,DNA重組及重組DNA技術(shù),細(xì)菌的可流動(dòng)性元件 A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示) B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因 C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L,DNA重組及重組DNA技術(shù),由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座,DNA重組及重組DNA技術(shù),四、原核細(xì)胞可通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移或重組,（一）接合作用,當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一

10、細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。,DNA重組及重組DNA技術(shù),可接合質(zhì)粒如 F 因子(F factor),細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。,質(zhì)粒,DNA重組及重組DNA技術(shù),（二）轉(zhuǎn)化作用,通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。,DNA重組及重組DNA技術(shù),例：溶菌時(shí)，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。,DNA重組及重組DNA技術(shù),（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（供體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

11、(transduction)。,DNA重組及重組DNA技術(shù),噬菌體的生活史,溶菌生長(zhǎng)途徑 (lysis pathway) 溶源菌生長(zhǎng)途徑 (lysogenic pathway),DNA重組及重組DNA技術(shù),第二節(jié) 重組DNA技術(shù),Recombinant DNA Technology,DNA重組及重組DNA技術(shù),重組DNA技術(shù)的發(fā)展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 1973年 美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。 1977年 美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上

12、重要的藥物。 1980年 開(kāi)始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。 1997年 英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。,DNA重組及重組DNA技術(shù),重組DNA技術(shù)相關(guān)概念,克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。,獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。,DNA克隆,DNA重組及重組DNA技術(shù),技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克?。?細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）,DNA重組及重組DNA技術(shù),其主要過(guò)程包括：在體外將目的DNA片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，從

13、而獲得單一DNA分子的大量拷貝。,重組DNA技術(shù)，又稱分子克隆（molecular cloning）或DNA克?。―NA cloning）或基因工程（genetic engineering）技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),目的： 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）,DNA重組及重組DNA技術(shù),一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶,DNA重組及重組DNA技術(shù),重組DNA技術(shù)中常用的工具酶,DNA重組及重組DNA技術(shù),限制性核酸內(nèi)切酶(restriction e

14、ndonuclease),限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是一類核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異序列, 并裂解磷酸二酯鍵。,+,Bam H,定義：,DNA重組及重組DNA技術(shù),與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。,、（基因工程技術(shù)中常用型）,分類：,作用：,DNA重組及重組DNA技術(shù),第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫； 第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個(gè)字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株

15、的第三種酶,DNA重組及重組DNA技術(shù),類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,DNA重組及重組DNA技術(shù),Bam H,+,Hind,+,平端切口,黏端切口,DNA重組及重組DNA技術(shù),有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍末端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,DNA重組及重組DNA技術(shù),來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同裂酶或同功異源酶。,+,Bam H,+,Bst,同裂酶：,DNA重組及重組DNA技術(shù),限制性內(nèi)切核酸

16、酶,DNA重組及重組DNA技術(shù),二、重組DNA技術(shù)中常用的載體,定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。,載體按功能分為 克隆載體(cloning vector) 表達(dá)載體(expression vector),DNA重組及重組DNA技術(shù),克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。,表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。,DNA重組及重組DNA技術(shù),（一）克隆載體,至少有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)使載體在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制

17、，并能使克隆的外源DNA片段得到同步擴(kuò)增； 至少有一個(gè)選擇標(biāo)志（selection marker）：選擇標(biāo)志是區(qū)分含與不含載體的細(xì)胞所必需的，包括抗生素抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lacZ）、營(yíng)養(yǎng)缺陷耐受基因等。 有適宜的RE的單一切點(diǎn)：載體中一般都構(gòu)建有一段特異性核苷酸序列，在這段序列中包含了多個(gè)RE的單一切點(diǎn)，可供外源基因插入時(shí)選擇，叫多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）。,1. 克隆載體應(yīng)具備的基本特點(diǎn),DNA重組及重組DNA技術(shù),（1）質(zhì)粒 (plasmid),特點(diǎn): 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。,2. 常用

18、的克隆載體,細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。,DNA重組及重組DNA技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),pUC18質(zhì)粒載體圖譜,DNA重組及重組DNA技術(shù),噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）,（2）噬菌體(phage),M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,DNA重組及重組DNA技術(shù),柯斯質(zhì)粒（cosmid）載體（又稱黏粒載體） 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosom

19、e, BAC) 動(dòng)物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）,（3）其他克隆載體,DNA重組及重組DNA技術(shù),（二）表達(dá)載體,表達(dá)載體是指用來(lái)在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。 根據(jù)宿主細(xì)胞分為： 原核表達(dá)載體 真核表達(dá)載體,DNA重組及重組DNA技術(shù),1. 原核表達(dá)載體,原核表達(dá)載體的基本組成,R：調(diào)節(jié)序列；P：?jiǎn)?dòng)子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列,DNA重組及重組DNA技術(shù),2. 真核表達(dá)載體,真核表達(dá)載體的基本組成,OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：?jiǎn)?dòng)子；MCS：多克隆位點(diǎn)； TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。,DNA重組及重組DNA技術(shù),

20、第三節(jié) 重組DNA技術(shù)基本原理 和操作步驟,DNA重組及重組DNA技術(shù),基本原理,DNA重組及重組DNA技術(shù),以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過(guò) 程,DNA重組及重組DNA技術(shù),（一）目的基因的分離獲取分,化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 PCR法 從基因組DNA文庫(kù)中獲取目的DNA 從cDNA文庫(kù)中獲取目的DNA,DNA重組及重組DNA技術(shù),化學(xué)合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。,DNA重組及重組DNA技術(shù),5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,2、PCR技術(shù)的工作原理,DNA重組及

21、重組DNA技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),PCR技術(shù)原理示意圖,DNA重組及重組DNA技術(shù),PCR的基本反應(yīng)步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,DNA重組及重組DNA技術(shù),模板DNA 特異性引物 耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR體系基本組成成分,DNA重組及重組DNA技術(shù),利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段； 利用簡(jiǎn)并引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得序列相似的基因片段； 利用隨機(jī)引物從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因。,PCR技術(shù)的主要用途,（一）目的基因的

22、克隆,DNA重組及重組DNA技術(shù),利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計(jì)引物在體外對(duì)目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點(diǎn)突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對(duì)模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突變,DNA重組及重組DNA技術(shù),將PCR技術(shù)引入DNA序列測(cè)定，使測(cè)序工作大為簡(jiǎn)化，也提高了測(cè)序的速度； 待測(cè)DNA片段既可克隆到特定的載體后進(jìn)行序列測(cè)定，也可直接測(cè)定。,PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測(cè)的敏感性 。,（四）DNA序列測(cè)定,（五）基因突變分析,DNA重組及重組DNA技術(shù),逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptio

23、n PCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對(duì)已知序列的RNA進(jìn)行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),幾種重要的PCR衍生技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進(jìn)行原位雜交，即可檢出待測(cè)DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。 原位PCR方法彌補(bǔ)了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴(kuò)增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。,（二）原位PCR技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),（三）實(shí)時(shí)PC

24、R技術(shù),實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。,DNA重組及重組DNA技術(shù),實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理,DNA重組及重組DNA技術(shù),實(shí)時(shí)PCR分類：,DNA重組及重組DNA技術(shù),圖20-3 TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)PCR原理示意圖,DNA重組及重組DNA技術(shù),組織或細(xì)胞染色體DNA,基因片斷,克隆載體,重組DNA分子,含重組分子的轉(zhuǎn)化菌,限制性內(nèi)切酶,受體菌,基因組DNA文庫(kù) 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合,從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因,DNA重組及重組DNA技術(shù),用隨機(jī)切割的真核生物染

25、色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù),DNA重組及重組DNA技術(shù),從cDNA文庫(kù)獲取目的基因,DNA重組及重組DNA技術(shù),（二）載體的選擇與構(gòu)建選,目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。,目的： 獲得某一目的基因或DNA片段 獲得目的DNA片段所編碼的蛋白質(zhì),DNA重組及重組DNA技術(shù),不同載體的克隆容量及適宜宿主細(xì)胞,DNA重組及重組DNA技術(shù),（三）目的DNA與載體連接接,方式：（1）單一相同黏端連接 （2）不同黏端連接 （3）通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接,黏端連接,DNA重組及重組DNA技術(shù),Bam H切割反應(yīng),T4 DNA連接酶 15C,單一相同黏端連接,DNA重組及重組DN

26、A技術(shù),不同黏端連接（定向克?。?DNA重組及重組DNA技術(shù),由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。,人工接頭(linker)連接,通過(guò)其他措施產(chǎn)生黏端進(jìn)行連接,DNA重組及重組DNA技術(shù),人工接頭及其應(yīng)用,DNA重組及重組DNA技術(shù),在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。,同聚物加尾連接,DNA重組及重組DNA技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),PCR法,針對(duì)目的DNA的5-和3-端，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，在每條引物的5-端分別加上不同的RE位點(diǎn)，然后以目的DNA為模板，經(jīng)P

27、CR 擴(kuò)增便可得到帶有引物序列的目的DNA，再用相應(yīng)RE切割PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生黏端，隨后便可與帶有相同黏端的線性化載體進(jìn)行有效連接。,DNA重組及重組DNA技術(shù),平端連接,限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端,適用于：,DNA重組及重組DNA技術(shù),DNA重組及重組DNA技術(shù),3. 粘-平末端連接,黏-平末端連接是指目的DNA和載體之間通過(guò)一端為黏端、另一端為平端的方式進(jìn)行連接。 屬于定向克隆,DNA重組及重組DNA技術(shù),受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(competent),導(dǎo)入方式： 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection),（四）重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn),DNA重組及重組DNA技術(shù),1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選 (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選 (2) 利用基因的插入失活/插入表達(dá) 特性篩選 (3) 利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選 (4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選,（五）重組體的篩選與鑒定篩,DNA重組及重組DNA技術(shù),2. 序列特異性篩選 (1) RE酶切法 (2) PCR法 (3) 核酸雜交法 (4) DNA測(cè)序法 3. 親和篩選法,DNA重組及重組DNA技術(shù),插入失活篩選帶有重組載體的克隆,DNA重組及重組DNA技術(shù)