1、第八章 PCR技術(shù)及其應(yīng)用,前言 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史 第一節(jié) PCR技術(shù)原理和工作方式 第二節(jié) PCR產(chǎn)物的克隆 第三節(jié) PCR擴(kuò)增未知DNA片段 第四節(jié) 與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR 第五節(jié) PCR產(chǎn)生DNA指紋 第六節(jié) 實(shí)時(shí)定量PCR,本課件是在網(wǎng)絡(luò)資源基礎(chǔ)上改進(jìn)而成，在此對(duì)有關(guān)人士特致感謝！,一、PCR的基本原理,類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。 首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,第一節(jié) PCR

2、技術(shù)原理和工作方式,Denature template DNA by heat (95 oC),Target Sequence,Target Sequence,模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；,PCR Cycle - Step 1 ,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,P

3、rimer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymeras

4、e,引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,7,1 緩沖液,10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室溫時(shí)約為

5、7.2)，還可能有添加劑、共溶劑等。廠商一般以10倍的貯存液形式提供。 Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 廠商一般以25mmol MgCl2+形式提供，使用濃度為0.5mmol/L至2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTPs、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,二、PCR反應(yīng)體系,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,8,2、脫氧三磷酸核苷(dNTPs) dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。 廠商一般提供為10mmol/L或4mm

6、ol/L的貯存液，使用濃度為0.2mmol/L左右。 dNTPs濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。 濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。 dNTPs可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,9,PCR引物的設(shè)計(jì)一般原則 1.引物長(zhǎng)度一般以1830bp為宜，過(guò)短則降低特異性，過(guò)長(zhǎng)則會(huì)引起引物間的退火而影響有效擴(kuò)增，同時(shí)也增加引物合成的成本。 2.解鏈溫度(Tm值)很重要，直接決定了擴(kuò)增中可使用的退火溫度(Ta值)的高低，較高時(shí)特異性增加，但退火效率下降，過(guò)低時(shí)退火效率較高，但特異性下降。兩條引物間的Tm值越

7、接近越好。 計(jì)算Tm值的方法很多，簡(jiǎn)易公式為Tm=4(G+C)+2(A+T)，適于短于20nt的引物。長(zhǎng)引物的Tm值計(jì)算公式見(jiàn)書(shū)，但比實(shí)際值往往偏低。 精確的Tm計(jì)算需要考慮緩沖液的鹽離子濃度和引物內(nèi)部的相鄰堿基的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。,3、引物 一般溶成10 mol/L的貯存液，使用濃度為0.1-0.5 mol/L。 濃度過(guò)低則產(chǎn)量低，過(guò)高則易導(dǎo)致錯(cuò)配，PCR特異性下降。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,10,3.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長(zhǎng)的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 4.要避免兩個(gè)引物間特別是3末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3末端堿基序列互補(bǔ)的，使它

8、們不能形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 5.G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在4060%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。 6.引物3末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對(duì)，并且3末端為G、C或T時(shí)引發(fā)效率較高，但3要避免較密的C+C或G+C連排。 7.引物5末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無(wú)關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列、ATG起始密碼子或啟動(dòng)子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。 8.引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,11,4、模板 單、雙鏈DNA均可。 一個(gè)PCR反

9、應(yīng)中104至107個(gè)模板分子可獲得較理想的效果，但由于PCR較靈敏，更少的模板分子數(shù)在循環(huán)數(shù)增加時(shí)也會(huì)得到大量擴(kuò)增。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類，模板純度不高往往是限制PCR擴(kuò)增的重要因素。 不同屬性的模板所加的理想的量不同，哺乳動(dòng)物基因組總DNA、酵母DNA、細(xì)菌DNA、質(zhì)粒、M13噬菌體作模板時(shí)，需要的量分別為1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。 模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,12,5、耐熱性的DNA聚合酶 有多種，均從耐熱性的細(xì)菌中分離出來(lái)，均耐高溫，普遍具有53聚合酶和53外切酶活性

10、，但在35外切酶活性(proofreading, 校正功能，決定保真度, fidelity)、耐熱性和附加功能上有差異。酶量增加使產(chǎn)量增加，但反應(yīng)特異性下降，酶量過(guò)少雖能保證特異性，但影響產(chǎn)量。常用的有： 1）Taq DNA聚合酶：最常用，來(lái)自嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)，95時(shí)的半衰期為40分鐘，75時(shí)活性最強(qiáng)，沒(méi)有校正功能，錯(cuò)配率為8.910-5至1.110-4。標(biāo)準(zhǔn)使用濃度一般為2.5 U/50 l。 2）Tth DNA聚合酶：來(lái)自嗜熱熱細(xì)菌(Thermus thermophilus) HB8，95時(shí)的半衰期為20分鐘，74時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，除在Mg2+催化下進(jìn)行常規(guī)的PC

11、R擴(kuò)增外，還具有在MnCl2催化下的高溫反轉(zhuǎn)錄功能。 3）Vent DNA聚合酶：來(lái)自嗜熱高溫球菌(Thermococcus litoralis)，100時(shí)的半衰期為1.8小時(shí)，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,13,4）Pwo DNA聚合酶：來(lái)自嗜熱細(xì)菌(Pyrococcus woesei)，100時(shí)的半衰期大于2小時(shí)，有校正功能，保真度高。 5）Pfu DNA聚合酶：來(lái)自激烈熱球菌(Pyrococcus fariosus)，具有極高的熱穩(wěn)定性，目前公認(rèn)是最保真的。 6）混合DNA聚合酶：將具有校正功能的酶與Taq酶按一定比例混合，

12、具有類似Taq的強(qiáng)啟動(dòng)合成能力，同時(shí)又有一定的保真度，而且具有一定的擴(kuò)增長(zhǎng)片段的能力。 Taq酶的延伸速度為1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min來(lái)預(yù)計(jì)。 PCR擴(kuò)增不是絕對(duì)真實(shí)的，因?yàn)榫咝Ｕδ艿腄NA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相對(duì)保真而已，錯(cuò)配率相差在兩個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)。 一些具校正功能的酶作PCR時(shí)，即使產(chǎn)物短也可能得不到產(chǎn)物，原因不明，估計(jì)可能與該酶的外切活性將引物降解有關(guān)。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,14,三、PCR反應(yīng)程序 1、常規(guī)程序： 94左右預(yù)變性幾十秒至幾分鐘； 94左右變性10秒至1

13、分鐘； 50-65左右退火30秒至1分鐘； 20-35個(gè)循環(huán) 72左右延伸30秒至幾分鐘； 72左右最后延伸和加尾3-10分鐘； 4-25保持3分鐘或更長(zhǎng)。 2、退火和延伸溫度： 退火溫度Ta值由Tm值決定，多數(shù)情況下Ta采用Tm減去3-5，較高時(shí)特異性強(qiáng)但退火效率低，較低時(shí)退火效率增加而非特異擴(kuò)增增加，可根據(jù)實(shí)際研究目的采用高特異性或低特異性退火。 當(dāng)退火溫度高到與延伸溫度接近時(shí)，可以將退火和延伸溫度合為一個(gè)，這時(shí)PCR就由三步法變成了兩步法。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,15,3、反應(yīng)時(shí)間： 變性步驟一般為5秒至1分鐘，變性溫度高時(shí)時(shí)間短，低時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，簡(jiǎn)單模板時(shí)間短

14、，復(fù)雜模板時(shí)間長(zhǎng)，尤其是直接用細(xì)胞作模板時(shí)預(yù)變性和變性時(shí)間都要長(zhǎng)。 退火時(shí)間一般為30秒至1分鐘即可，引物結(jié)構(gòu)好的時(shí)間短，引物結(jié)構(gòu)差的退火時(shí)間宜長(zhǎng)。 延伸時(shí)間從半分鐘到10分鐘以上不等，由擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的延伸速度共同決定。Taq擴(kuò)增時(shí)按1kb/min計(jì)算，具校正活性的酶則按0.6-0.7kb/min計(jì)算。 4、循環(huán)次數(shù)： 多數(shù)為25-35，主要取決于模板屬性、模板豐度、引物退火效率DNA聚合酶的擴(kuò)增能力。裸露DNA、雜質(zhì)少、高豐度模板、引物結(jié)構(gòu)好、DNA聚合酶擴(kuò)增能力強(qiáng)時(shí)，循環(huán)數(shù)宜少，以盡量減少突變。否則宜多，以保證獲得必要的PCR產(chǎn)物量。 PCR擴(kuò)增的后期循環(huán)易進(jìn)入平臺(tái)期，實(shí)際

15、上是由于PCR擴(kuò)增條件的逐步劣化而引起的。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,16,5、PCR反應(yīng)液的配制： 加試劑順序：雙蒸水、緩沖液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前應(yīng)將其余試劑混勻后再加入酶。加完酶后應(yīng)先放回酶，然后再混勻PCR成分，覆蓋礦物油，并上機(jī)。 酶要用冰盒取放，禁止因手的接觸或暴露于空氣中而使酶升溫。 第一次使用各試劑時(shí)要輕柔充分混勻。 正確保存各種試劑，尤其是要避免核酸因反復(fù)凍融而降解，各試劑宜分裝成適量的小管。 熱啟動(dòng)(hot start)：購(gòu)買的DNA聚合酶偶連有特異抗體，只有當(dāng)溫度升至68度或更高時(shí)，抗體

16、才會(huì)失活并釋放出DNA聚合酶，從而增加PCR的特異性，減少低溫下尤其是配制PCR體系過(guò)程中由于引物錯(cuò)配而帶來(lái)的非特異性擴(kuò)進(jìn)。但啟動(dòng)的DNA聚合酶的價(jià)格較貴。早期有蠟珠法。 冷啟動(dòng)(cool start)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已運(yùn)行并暫停于預(yù)變性之初的PCR儀的block上面，直接進(jìn)入高溫變性和隨后的PCR擴(kuò)增。 延遲成分法：扣留一種PCR關(guān)鍵成分，直到已進(jìn)入預(yù)變性后才加入。,PCR中其它注意的事項(xiàng),1.防止污染 試劑小量分裝 吸頭及EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開(kāi)，無(wú)菌操作 2.設(shè)立對(duì)照： 陽(yáng)性對(duì)照： 陽(yáng)性模板 陰性對(duì)照： 陰性模板、無(wú)模板 試劑對(duì)照： 除模板外的所有組

17、分,第二節(jié) PCR產(chǎn)物的克隆,一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點(diǎn) 在PCR引物的5加上根據(jù)需要而設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物內(nèi)部沒(méi)有該切點(diǎn)。 在酶切位點(diǎn)的5加3個(gè)左右的保護(hù)堿基，基數(shù)目多少取決該酶的性質(zhì)。 PCR物產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收后，直接用限制酶進(jìn)行切割，純化后與目標(biāo)載體連接重組。 該法適用于直接將PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體進(jìn)行功能研究，但構(gòu)建好的表達(dá)載體必須測(cè)序才能證明PCR產(chǎn)物的身份正確且沒(méi)有突變。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,20,二、TA克隆 這是目前最通行的PCR產(chǎn)物克隆方法，基本思路是先將PCR產(chǎn)物與特制的T載體進(jìn)行連接重組，測(cè)序證明正確無(wú)誤后，再?gòu)腡載體上

18、亞克隆到表達(dá)載體上進(jìn)行功能研究。 Taq酶PCR產(chǎn)物的特點(diǎn)：該酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，通常在其產(chǎn)物DNA分子每條鏈的3末端加上一個(gè)突出的A。 T載體：通過(guò)特定制作技術(shù)制作的在多克隆位點(diǎn)中間已開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒載體，其每條鏈的3末端具有一個(gè)突出的T，如promega公司的pGEM T-easy。 TA克?。簩?末端具一個(gè)突出的A的PCR產(chǎn)物與T載體連接重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的重組克隆子的多克隆位點(diǎn)區(qū)的插入片段進(jìn)行測(cè)序，然后再亞克隆到其它載體進(jìn)行功能研究等。 pCR-TOPO技術(shù)：T載體上已經(jīng)偶連有拓?fù)洚悩?gòu)酶，因此PCR產(chǎn)物無(wú)需DNA連接酶而可直接與該T載體進(jìn)行快速連接重組。,2020/6/24,

19、西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,21,三、平末端DNA片段的克隆 所有具有校正功能的DNA聚合酶擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物均為平末端，有兩種克隆思路： 一是在PCR完成后加入適量的Taq酶并在72保溫20-30分鐘，使PCR產(chǎn)物每條鏈的3末端加上一個(gè)突出的A后進(jìn)行TA克隆。 二是將平末端PCR產(chǎn)物與平末端進(jìn)行載體連接克?。?1、pCR-Script Amp SK(+)克隆載體：連接體系中除加有T4 DNA連接酶外，還加有限制酶Srf，連接過(guò)程中載體自連的產(chǎn)物總是被Srf切開(kāi)，而重組載體確不能被切開(kāi)，轉(zhuǎn)化子中重組子的比例就較高。 2、pCR-Blunt克隆載體：載體的lacZ基因下游融合了一個(gè)致死基因

20、ccdB，載體自連轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不能存活，重組載體的轉(zhuǎn)化子則能長(zhǎng)成菌落，因?yàn)橹滤阑蛞驯徊迦胧Щ睢?2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,22,四、長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增 長(zhǎng)片段DNA的PCR擴(kuò)增效率較低，因?yàn)橛性S多降低PCR效率的因素。 策略有： 一是改進(jìn)PCR緩沖液體系。 二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴(kuò)增40kb左右的片段。,一、反向PCR (reverse PCR),是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,

21、擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。,已知序列,未知序列,未知序列,第三節(jié) PCR擴(kuò)增未知DNA片段,二、利用接頭的PCR/錨定PCR (anchored PCR),將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列已知的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與已知序列中的基因特異引物(gene-specific primer, GSP)組合后，用于目標(biāo)基因側(cè)翼序列的擴(kuò)增。 為了減少錨定引物與錨定引物之間組合后構(gòu)成的非特異擴(kuò)增，可以將接頭替換為一端平、另一端為5突變的結(jié)構(gòu)，且對(duì)3凹陷的堿基實(shí)行亞氨基修飾。,不對(duì)稱PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。 方法：采用兩種

22、不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。 用途：制備核酸序列測(cè)定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,三、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR),2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,26,TAIL-PCR： 利用特異引物與隨機(jī)引物組合后進(jìn)行PCR，產(chǎn)生3種產(chǎn)物： 型產(chǎn)物：特異引物和隨機(jī)引物共同延伸的產(chǎn)物； 型產(chǎn)物：特異引物單獨(dú)延伸的產(chǎn)物； 型產(chǎn)物：隨機(jī)引物單獨(dú)延伸的產(chǎn)物。 5輪高嚴(yán)謹(jǐn)度PCR，形成特異引物介導(dǎo)的目標(biāo)序列的單鏈擴(kuò)增； 1個(gè)低嚴(yán)謹(jǐn)度PCR循環(huán)，將目標(biāo)序列轉(zhuǎn)換為雙鏈； 高嚴(yán)謹(jǐn)度與低嚴(yán)謹(jǐn)度循環(huán)交錯(cuò)進(jìn)行，共14個(gè)超級(jí)循環(huán)； PCR產(chǎn)物稀釋1000倍； 換用新的特異引物與隨機(jī)引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，10個(gè)超級(jí)循環(huán)； PCR產(chǎn)物稀釋1000倍； 換用第三特異