1、.,實驗三 魚類血液涂片制作與血細胞計數(shù),血液：是一種由血漿和血細胞組成的流體組織，由心臟搏動推動在心血管系統(tǒng)中不斷循環(huán)流動，具有運輸、防御和免疫、維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定和參與體液調(diào)節(jié)等多種功能。,.,血液具有維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，正常情況下血液中的的各項生理指標處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，同時各項指標也能夠反映一個生物個體的健康程度，因而血液檢測已成為疾病檢測最基本的技術。,多種多樣的血液檢測儀,.,血液檢測能夠輔助疾病診斷,.,血涂片的顯微檢查是血液細胞學檢查的基本方法，也是生物顯微制片的基本方法之一，臨床上應用極為廣泛，特別是對于各種血液病的診斷具有重要的價值。制備厚薄適宜，分布均勻，染色良

2、好的血涂片是血液學檢查的重要基本技術。,人體血液涂片,.,血液涂片技術在水產(chǎn)動物疾病檢測過程中也有非常重要的作用，比如細菌感染、病毒感染以及血液寄生蟲疾病的檢測。目前該技術已成為水產(chǎn)技術從業(yè)人員的必備技能，也是執(zhí)業(yè)資格考試的重點內(nèi)容。,.,.,.,涂片經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色液染色后，相應各類細胞呈現(xiàn)不同的著色，從而達到辨別其形態(tài)特征的目的。一般細胞的細胞核嗜堿性，能被堿性燃料染成藍色，而細胞質(zhì)基質(zhì)嗜酸性，能被酸性燃料染成紅色。,.,血細胞計數(shù)法是將小量待測樣品血液的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱細胞計數(shù)板），于顯微鏡下直接計數(shù)，根據(jù)血液稀釋的倍數(shù)，進一步推算出血液中血細胞數(shù)

3、的一種方法。,.,.,.,.,魚類麻醉前后對比示意圖,.,2、血液的采集 將準備好的2mL注射器，抽動活塞用肝素鈉溶液將注射器內(nèi)濕潤，為血液的采集做好準備工作。血液的采集按實驗2的采血方法進行，采好的血液保存于1.5 mL離心管中待用。,.,3、推片 取一塊邊緣光滑的載片做推片。將其一端刮取血滴，迅速使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈3040，向另一端平穩(wěn)地推出，涂片推好后，放置于空氣中使之自然干燥。 （1）將采出的血液滴在載片上,.,（2）另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀。,.,（3）兩玻片的角度以30-45為宜

4、，輕輕將雙凹片向前勻速推進，即涂成血液薄膜。,.,（4）血涂片,.,不良血涂片,.,4、血涂片染色 先將干燥血片用甲醇固定3-5分鐘，將固定的血片置于被pH 6.4-6.8磷酸鹽緩沖液稀釋10-20倍的吉姆薩染液中，浸染5分鐘（標本較少可用滴染法），取出用蒸餾水沖洗，再用伊紅復染1分鐘，用蒸餾水沖洗，待干后鏡檢。,.,沖洗后滴加少量伊紅，染色1分鐘,直接流水沖洗1分鐘 （切勿先倒掉染液）,涂片經(jīng)水洗干燥后鏡檢,涂片干燥后加吉姆薩染液染色5分鐘,.,二、血細胞計數(shù),血細胞計數(shù)板的結構 XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板分25個中格。0.1mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm

5、2表示計數(shù)室面積是1mm2 ，分為400個小格，每小格面積是1/400mm2。,.,.,1、血液稀釋 用10微升移液槍取10微升血液于一新的1.5mL離心管中，再用1000微升移液槍吸990微升生理鹽水于離心管中（稀釋100倍），輕輕顛倒混勻。 2、計數(shù)板處理 用無水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計數(shù)板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計數(shù)板上面。 3、充液 取干凈的計數(shù)板平放于實驗桌上，將蓋玻片置入計數(shù)板正中央。用毛細血管吸取已稀釋混勻后的血細胞懸浮液，并將管尖輕輕斜置于蓋玻片邊緣，讓血細胞懸液緩慢流出，借毛細管現(xiàn)象而自動流入計數(shù)室內(nèi)。,.,.,4、靜置 血細胞懸液充入計數(shù)室后，靜置23

6、分鐘，待細胞不再浮動后，于低倍鏡下觀察計數(shù)室內(nèi)待計數(shù)的血細胞分布是否均勻，分布均勻者，方可計數(shù)。,.,5、按圖計算計數(shù)板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時，只計數(shù)完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。,.,6、計算 計完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.01 cm2，高為0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml1000 mm3，所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)10000細胞數(shù)/ml，故可按下式計算： 細胞懸液細胞數(shù)/ml4個大格細胞總數(shù)/410 000 如計數(shù)前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。,.,血細胞計數(shù)換算公式： 1625：計數(shù)個數(shù)40010000100稀釋倍數(shù) （單位：個/ml） 2516：計數(shù)個數(shù)4001000080稀釋倍數(shù) （單位：個/ml）,.,.,4移液槍的使用要按規(guī)定使用，使用時不要過力按壓移液槍，用完后要將量程回到移液槍的最大量程處。 5鏡下計數(shù)時，若方格中細胞分布明顯不均，說明