1、 1,1,Noncoding RNA,海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院,2,3,RNA的研究進(jìn)展,RNA組學(xué)：通過對 R N A的研究所取得的巨大成果而形成了 R N A組。 RNA研究已有百余年的歷史，其間有兩個階段時期。 第一個階段：20世紀(jì)的 50 60年代，各種RNA開始被發(fā)現(xiàn)，但對RNA的認(rèn)識還不深入。 第二個階段：20世紀(jì)的 80年代，RNA的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究表明RNA在遺傳方面的重要作用。,4,Non-coding RNA（非編碼RNA）,非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多種已知功能的 RNA，

2、還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點(diǎn)是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物學(xué)功能了。,5,分類,非編碼RNA 從長度上來劃分可以分為3類： 小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA； 50 nt到500 nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA 等等； 大于500 nt，包括長的mRNA-like 的非編碼RNA，長的不帶polyA 尾巴的非編碼RNA等等。,6,根據(jù)亞細(xì)胞定位可將非編碼 RNA 分為： 細(xì)胞核非編碼 RNA 與細(xì)胞質(zhì)非編碼 RNA。 根據(jù)是否具有polyA尾結(jié)構(gòu)可將非編

3、碼RNA分為 具有polyA 尾的非編碼 RNA(polyA-plus ncRNAs)和不具有 polyA 尾的非編碼 RNA(polyA-minus ncRNAs。 根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的長度可將非編碼 RNA 分為 小非編碼 RNA 和長鏈非編碼 RNA。,7,分類,根據(jù)生物學(xué)功能可將非編碼 RNA 分為： 持家非編碼 RNA 和調(diào)控性非編碼 RNA。持家非編碼RNA 主要包括核糖體 RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn) RNA(tRNA)、小核 RNA (snRNA)、小核仁 RNA(snoRNA)、引導(dǎo)RNA(gRNA)和端粒酶 RNA; 調(diào)控性非編碼RNA主要包括小干擾 RNA(siRNA)、微小 RNA

4、(microRNA)、與 Piwi蛋白相互作用的 piRNA 和長鏈非編碼 RNA (lncRNAs)。,8,分類,調(diào)控非編碼RNA：長鏈非編碼RNA （lncRNA） 短鏈非編碼RNA（siRNA、miRNA、piRNA）,非編碼RNA,看家非編碼RNA,9,調(diào)控非編碼RNA,長鏈非編碼RNA （lncRNA） 長鏈非編碼RNA通常是指長度大于200個核苷酸的非編碼 RNA 轉(zhuǎn)錄本。該概念是在 2002 年由日本科學(xué)家首次提出, 他們在小鼠全長 cDNA 文庫的大規(guī)模測序中, 鑒定了大量較長的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。 短鏈非編碼 RNA（siRNA、miRNA、piRNA） 它們的轉(zhuǎn)錄本序列都比

5、較短，不超過 40 nt 短鏈非編碼 RNA 分子雖小，卻參與了包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞代謝以及機(jī)體免疫在內(nèi)的幾乎所有生命活動的調(diào)節(jié)和控制，在生命體內(nèi)扮演著至關(guān)重要的角色。,10,長鏈非編碼RNA （lncRNA）,lncRNA不參與或很少參與蛋白編碼功能, 位于細(xì)胞核內(nèi)或胞漿內(nèi)。 近年來的研究表明，lncRNA參與了X 染色體沉默、染色體修飾和基因組修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^程，其調(diào)控作用正在被越來越多的人研究。,11,1.編碼蛋白的基因上游啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)； 2.抑制RNA聚合酶II或者介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)以及組蛋白修飾，影響下游基因的表達(dá)； 3.與編碼蛋白基因

6、的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切，形成不同的剪切形式； 4.與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA； 5.與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，lncRNA轉(zhuǎn)錄本可調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性； 6.作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體； 7.結(jié)合到特定蛋白質(zhì)上，改變該蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位； 8.作為小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前體分子。,12,RNA (small noncoding RNA),miRNA(microRNA) siRNA (small interfering RNA) piRNA(piwi-interacting RNA) esiRNA (en

7、dogenous siRNA),13,siRNA,siRNA:是一類外源性的雙鏈小分子RNA，它的長度一般為2125 nt。它在RNA干擾途徑中通過引導(dǎo)目的基因mRNA的降解，以抑制mRNA的表達(dá)。 siRNA也可經(jīng)由多種不同轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并對特定基因產(chǎn)生具專一性的基因敲除（knockdown）效果，這使siRNA成為研究基因功能與藥物目標(biāo)的一項重要工具。也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。,14,miRNA,概念： miRNA是長約2125nt的單鏈RNA, 其中50%定位于易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變的染色體區(qū)域。 特點(diǎn)： miRNA

8、 是內(nèi)源性的, 是生物體基因的表達(dá)產(chǎn)物;miRNA 是由不完整的發(fā)卡狀雙鏈 RNA, 經(jīng) Drosha 和 Dicer 酶加工而成。,15,piRNA,piRNA 是近年來在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的長度約為 2431 nt 的 RNA 分子, 因在生理狀態(tài)下能與piwi蛋白偶聯(lián), 故命名piRNA。 由于 Piwi 為一表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子, 能與 PcG 蛋白共同結(jié)合于基因組 PcG 應(yīng)答元件上, 協(xié)助 PcG 沉默同源異型基因, 因此推測與 Piwi相關(guān)的 piRNA 也應(yīng)具有表觀遺傳學(xué)的調(diào)控作用,16,piRNA的形成及擴(kuò)增,piRNA前體與piwi蛋白結(jié)合后，能在u位點(diǎn)進(jìn)行切割形成piRNA

9、反義鏈，piRNA反義鏈能與轉(zhuǎn)座子識別，并使切割后的轉(zhuǎn)座子與AGO3蛋白結(jié)合，從而進(jìn)一步對轉(zhuǎn)座子進(jìn)行修飾切割，切割后的轉(zhuǎn)座子可以與piRNA前體結(jié)合，并且在U位點(diǎn)切割前體，從而使切割后的前體與piwi蛋白結(jié)合，進(jìn)過剪切修飾形成PiRNA和PiRNA與Piwi蛋白結(jié)合的復(fù)合體，從而使PiRNA數(shù)量增多。,17,非編碼RNA的比較,18,非編碼 RNA的作用,1. 影響染色體的結(jié)構(gòu) 2. 調(diào)控轉(zhuǎn)錄 3. 參與RNA的加工、修飾 4 .參與 mRNA的穩(wěn)定和翻譯調(diào)控過程 5 .影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn) 6. 在植物適應(yīng)環(huán)境脅迫中的調(diào)控作用 7. 在細(xì)胞發(fā)育和分化中的調(diào)控作用,19,非編碼RNA的檢測技

10、術(shù),cDNA克隆策略 實(shí)時熒光定量（RT-PCR技術(shù)） SAGE技術(shù) 微陣列芯片檢測技術(shù) Solexa測序法 表面增強(qiáng)拉曼光譜法,20,cDNA克隆策略,長度在20500bp的RNA大多為非編碼RNA。非編碼RNA可將由變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離到的非編碼RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后加上接頭，并克隆到標(biāo)準(zhǔn)載體中構(gòu)建cDNA文庫。為防止5端丟失常在 3 端加上C- 尾巴，在T4RNA連接酶的作用下連上寡聚核苷酸接頭，最后對連接產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。 cDNA克隆策略可鑒別已知的高豐度非編碼RNA，如tRNAs或小核糖體RNA。,21,實(shí)時熒光定量（RT-PCR技術(shù)）,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種高通量

11、、靈敏的基因表達(dá)檢測技術(shù)，常用于蛋白編碼基因表達(dá)檢測，也被廣泛地應(yīng)用于microRNA或其他非編碼RNA的表達(dá)檢測。 通過該技術(shù)，可定量監(jiān)測目的基因的表達(dá)情況，篩選生物學(xué)功能相關(guān)的非編碼RNA。,22,SAGE技術(shù),SAGE是一種高通量的研究技術(shù)，通過逆轉(zhuǎn)錄得到 c D N A ,從而獲得 S A G E 雙標(biāo)簽,然后,通過連接、擴(kuò)增雙標(biāo)簽片段并進(jìn)行克隆、測序，以同一標(biāo)簽在某組織中出現(xiàn)的頻率，反映該標(biāo)簽所代表的基因在該組織中的表達(dá)豐度 。 與微陣列芯片技術(shù)相比，SAGE可在未知任何基因或EST序列的情況下，對靶細(xì)胞進(jìn)行研究，具有顯著的優(yōu)越性。,23,微陣列芯片檢測技術(shù),微陣列芯片以高密度陣列為

12、特征，在微陣列上固定大量探針分子，并將標(biāo)記樣本與微陣列探針進(jìn)行雜交 。通過檢測雜交信號的強(qiáng)度，研究不同樣本中特異基因的表達(dá)豐度，從而較為全面地比較不同樣本中基因表達(dá)水平的差異。 被廣泛用于mRNA的研究，也被用于非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)與表達(dá)分析 。,24,Solexa測序法,Solexa測序法是新發(fā)明并迅速得到廣泛應(yīng)用的一種高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)，該方法是利用單分子陣列來測定基因的表達(dá)情況。首先，將核酸從細(xì)胞中提取，將其片段化為100200堿基大小，分別連上接頭，經(jīng)接頭引物的PCR擴(kuò)增后制成文庫；然后，將已加入接頭的核酸片段固定在含有接頭的芯片上，經(jīng)反應(yīng)后，將不同片段擴(kuò)增。 在每個循環(huán)中，利用邊合

13、成邊測序的原理，在單分子陣列中加入4種熒光標(biāo)記染料的核苷和聚合酶，在酶的作用下，每個單鏈DNA分子通過互補(bǔ)堿基的配對被延伸，通過CCD采集熒光信號，快速掃描整個陣列，檢測特定的結(jié)合在每個片段上的堿基，從而進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄本的測序。,25,盡管Solexa測序技術(shù)以高效率、高精確鑒定miRNA著稱，但相對于傳統(tǒng)、普遍使用的miRNA定量方法還存在一定的不足，這可能是由于測序深度不足，或一些microRNA存在特殊修飾而帶來的問題 。,26,表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS）,利用水的拉曼散射很微弱這一特點(diǎn)，高靈敏度和特異性的SERS檢測技術(shù)逐漸成為研究水相中的生物和化學(xué)樣品的理想工具，應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、

14、蛋白和核酸等生物樣品的檢測。,27,克隆非編碼RNA的方法,基因克隆法 蛋白質(zhì) - R N A復(fù)合物分離法,28,基因克隆法,小鼠腦 組織勻漿 提取總RNA 8%PAGE回收50-110nt（fractional）和 110-500nt（fractional） Poly(A)聚合酶加尾 cDNApSPORTI PCR 高密度陳列 雜交除去高豐度已知的小RNA 未雜交的cDNA測序。,29,蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物分離法,分離蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)，純化RNA分子，反轉(zhuǎn)錄cDNA ，克隆、測序、結(jié)果分析。所得RNA的cDNA分子必須進(jìn)行Northern雜交，除去斷裂的小RNA。,30,mi

15、croRNA,31,32,33,34,2001年命名為microRNA,2002年入選為science年度十大發(fā)現(xiàn)之首,35,36,37,38,39,40,41,42,43,Micro RNA,microRNA（簡稱miRNA）是一種非編碼小RNA分子（約含22個核苷酸，19 25）存在于植物，動物和一些病毒中，其功能在RNA沉默和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。,44,miRNA的特點(diǎn),單鏈RNA 19 25nt，非編碼RNA 單一的目標(biāo)miRNA可能靶向數(shù)百個基因 抑制翻譯（動物）或降解靶RNA（植物） 對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、癌變及病毒感染起調(diào)控作用 保守性進(jìn)化,3.miRNA的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn),

16、2.miRNA的作用機(jī)理,1.miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn),3.miRNA的鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn),2.miRNA的作用機(jī)理,1.miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn),第一節(jié),miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn),miRNA的產(chǎn)生：植物miRNA的形成包括miRNA基因轉(zhuǎn)錄、加工成熟和功能復(fù)合體組配三個過程。 miRNA基因轉(zhuǎn)錄：通過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核中形成初級轉(zhuǎn)錄本，稱為primary miRNAs（pri-miRNAs）。植物的pri-miRNA通常由腺苷酸開頭，具有5 帽子和3-polyA尾，位于一個保守的TATA-box序列的下游40 個核苷酸序列處。,第一節(jié),miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn),加工成熟：植物 miRNA 的加工成

17、熟過程是由存在細(xì)胞核內(nèi)的 Dicer 酶類似物，在HYL1蛋白的協(xié)助下，以一種ATP依賴的方式，通過兩次剪切步驟生成。第一次剪切pri-miRNA后，產(chǎn)生具有莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，接著在兩個蛋白酶HYL1和SERRATE的協(xié)助下再次切割pre-miRNA，將miRNA/miRNA*二聚體從pre-miRNA 莖環(huán)結(jié)構(gòu)的“莖”上剪切下來。miRNA 基因在細(xì)胞核中經(jīng)由RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、DCL1剪切后和HEN1介導(dǎo)的甲基化后，由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HASTY（HST）從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。,第一節(jié),miRNA的產(chǎn)生和特點(diǎn),功能復(fù)合體組配：miRNA/miRNA*二聚體

18、中miRNA鏈在SDN的誘導(dǎo)下裝載進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC），成熟miRNA與ARGONAUTE1（AGO1）蛋白結(jié)合，形成非對稱的RISC，而miRNA*則被降解。miRNA引導(dǎo)RISC切割目標(biāo)靶基因mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)功能 。,50,micorRNA的產(chǎn)生,51,micorRNA的產(chǎn)生,52,micorRNA的產(chǎn)生,53,micorRNA的產(chǎn)生,54,RISC：RNA-Induced Silencing Complex,一種多結(jié)構(gòu)域的雙鏈RNA專一性RNase ,55,miRNA如何行使功能？,與mRNA

19、的3端非編碼區(qū)特定位點(diǎn)(其第28個核苷酸)綁定： 與mRNA完美互補(bǔ)時會引發(fā)mRNA降解； 不完美的與mRNA配對時，會引發(fā)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（抑制靶基因的表達(dá)） 從而抑制或阻止相應(yīng)的mRNA翻譯過程。 舉例分析：在DNA修復(fù)通路中行使上述過程 1）抑制或阻止正常細(xì)胞DNA修復(fù)產(chǎn)生致癌作用 2）抑制或阻止癌細(xì)胞DNA修復(fù)達(dá)到治療效果,56,植物miRNA 的特點(diǎn),植物miRNA與動物miRNA的相類似特點(diǎn) (1)miRNA廣泛存在于真核生物中。 (2)miRNA 的長度約為2024 nt。 (3)miRNA 沒有開放閱讀框(ORF)及蛋白質(zhì)編碼基因特點(diǎn)。 (4)miRNA的基因成簇性。 (5)m

20、iRNA 的保守性。,57,植物miRNA 的特點(diǎn),植物miRNA與動物miRNA的相類似特點(diǎn) (6)miRNA表達(dá)的時空特異性。 (7)幾乎所有的miRNA從前體的1條臂中加工而來。 (8)miRNA 的5 端多以U 開頭 。,58,植物miRNA 的特點(diǎn),植物miRNA與動物miRNA的不同特點(diǎn) (1)植物miRNA前體的大小變化較大，一般為64303 nt，而動物miRNA前體的變化較小，一般為6075 nt。 (2)植物中的miRNA較動物中的更為保守，它們與互補(bǔ)序列的錯配數(shù)也少于動物。,59,植物miRNA 的形成,miRNA成熟所需的酶類 一種多結(jié)構(gòu)域的雙鏈RNA專一性RNase

21、1II(Dicer酶、類Dicer酶)和Argonaute蛋白。 Dicer酶包含4種結(jié)構(gòu)域：RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ(PiwiArgonauteZwille)結(jié)構(gòu)域、2個RNase結(jié)構(gòu)域和dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD) Argonaute蛋白具有PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域 。,60,植物miRNA 的作用機(jī)制,miRNA的作用方式可根據(jù)其與靶基因的互補(bǔ)程度不同而分為兩種：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物裂解和翻譯抑制。 a.當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)或接近完全互補(bǔ)時，則會切割mRNA； b.當(dāng)植物miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)時，則抑制其翻譯。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA也可以通過目標(biāo)染色體位點(diǎn)的甲基化，

22、或通過調(diào)控靶mRNA的定位或穩(wěn)定性在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用。,61,植物miRNA 的功能,1 抗生物脅迫 植物中存在一類miRNA與多種植物病毒基因完全或不完全互補(bǔ)，推測這類miRNA 可通過切割病毒基因抑制病毒侵染。 2 抗非生物脅迫 21 抗?fàn)I養(yǎng)脅迫 (1)調(diào)節(jié)植物磷代謝平衡 Chiou 發(fā)現(xiàn)，在磷脅迫下，擬南芥中miR399大量表達(dá)；而在高磷條件下，未檢測到miR399的表達(dá)。 (2)調(diào)節(jié)植物硫代謝平衡 miR395在高硫條件下不表達(dá)，在硫缺失脅迫下表達(dá) 。,62,63,植物miRNA 的功能,2 抗非生物脅迫 22 抗環(huán)境脅迫 miRNA可以使植物抵抗寒冷、高濃度ABA、干旱、高鹽等極端

23、自然環(huán)境 及抵抗環(huán)境引起的自身氧化脅迫 。,64,65,miRNA的檢測,miRNA的獲取 miRNA的確認(rèn) miRNA的檢測方法,66,miRNA的獲取,miRNA 分子的序列短小 1）在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列 2）在不同生物體內(nèi)與靶基因結(jié)合的方式也不盡相同 3）通常與多種蛋白相互作用 這使得建立一個有效而且普遍適用的研究方法異常困難。 #到目前為止,miRBase上公布的miRNA總數(shù)將近3 000種。 #現(xiàn)在已知靶基因的miRNA多是通過基因克隆和生物信息學(xué)篩選的方法發(fā)現(xiàn)的。,67,miRNA的獲取基因克隆,1.1 基因克隆 直接克隆的方法通常是從總RNA中提取大約22 nt的小RN

24、A分子,制備一個小RNA的cDNA(complementary DNA)文庫。將文庫中的小RNA序列與基因組數(shù)據(jù)庫中BLAST序列類似性 比對,排除非miRNA 序列后,通過Northern印跡方法(Northern blotting) 得到最終確認(rèn)。目前大量的已知miRNA都是通過這種方法獲得的。 基因克隆方法的優(yōu)點(diǎn)是對于高豐度或常表達(dá)的基因來說,可以獲得完整的miRNA序列。然而對于另一些miRNA,它們在生物體內(nèi)濃度很低(表達(dá)量低或表達(dá)產(chǎn)物極不穩(wěn)定,或前體到成熟的加工效率低等原因引起) ,或者某些只在生物體的特定時期或特定組織器官中表達(dá),直接克隆法則無法獲取。 注：Northern印跡雜

25、交（Northern blot）。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。,68,miRNA的獲取生物信息學(xué)篩選,1.2 生物信息學(xué)篩選 隨著生物全基因組測序的完成,利用計算機(jī)對基因組序列進(jìn)行搜索可以大大提高miRNA的鑒定效率。所以,人們根據(jù)目前已知的miRNA基因序列總結(jié)它們的特征和規(guī)律,編寫了一些計算機(jī)程序,通過對生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,可以找到那些可能為miRNA的基因序列,然后通過Northern blotting來篩選真正的miRNA 基因。 生物信息學(xué)方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的miRNA 具有較大的序列同源性以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性這一特征

26、在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索新的miRNA 基因。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理并結(jié)合生物信息軟件在已測序基因組中進(jìn)行搜索比對，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過實(shí)驗(yàn)鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數(shù)量。近年來隨著miRNA預(yù)測方法的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量呈幾何級數(shù)增長。這些預(yù)測方法從簡單的序列比對搜索發(fā)展到現(xiàn)在的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，程序設(shè)計越來越智能化，復(fù)雜化。,69,miRNA的獲取生物信息學(xué)篩選,隨著人miRNA基因轉(zhuǎn)錄出的pri-miRNA迅速加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，隨后被切割成miRNA：miRN

27、A*雙體，并被選擇性地組合進(jìn)核糖核酸沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（RISC）并進(jìn)行靶基因識別。在相似的物種中，miRNA是很保守的；但在相距較遠(yuǎn)的物種間，miRNA又有一定的分歧，尤其體現(xiàn)在pre-miRNA上。這些miRNA功能作用機(jī)制的闡明為預(yù)測軟件的研發(fā)提供了理論依據(jù)，但仍需要不斷修補(bǔ)和完善。近年來，幾個基于這些規(guī)則的miRNA預(yù)測程序先后被開發(fā)（下表），并被廣泛使用。 生物信息學(xué)手段可以說是一種更高通量的方法。通常有以下幾種方法: Mirscan是一種基于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,通過掃描兩種系之間是否存在同源的莖環(huán)結(jié)構(gòu), 應(yīng)用于檢測脊椎動物和線蟲的候選基因。,70,miRNA的獲取生物信息學(xué)篩選,Mir

28、seeker是一種檢查RNA序列莖環(huán)結(jié)構(gòu)的預(yù)測程序,應(yīng)用于篩選昆蟲的候選基因。 它是根據(jù)3個標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測的:一是具有長度為70100 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Pre-miRNA;二是不同種系生物中Pre-miRNA的保守性;三是miRNA的核苷酸差異性。 ERP IN是一種類似于BLAST的校對程序,用于搜尋動物基因組中與miRNA 序列類似的序列。 MiPred可以通過random forest預(yù)測模型和miRNA特征的結(jié)合,區(qū)分miRNA 的真正前體和假冒前體。,71,72,73,miRBase序列數(shù)據(jù)庫,miRBase序列數(shù)據(jù)庫是一個提供包括miRNA序列數(shù)據(jù)、注釋、預(yù)測基因靶標(biāo)等信息的全方位數(shù)據(jù)庫

29、，是存儲miRNA信息最主要的公共數(shù)據(jù)庫之一。miRBase提供便捷的網(wǎng)上查詢服務(wù)，允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的miRNA和靶標(biāo)信息，詳情請（/）。 2012年8月1日正式發(fā)布。相比于以往版本的數(shù)據(jù)庫（Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫），19.0版數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了巨大的數(shù)據(jù)更新：miRNA發(fā)夾前體序列已升至21264條，新增3171條；成熟miRNA升至25141條，新增3625條；已發(fā)布的miRNA序列共涵蓋193個物種，相比于18.0版新增25個物種。新版數(shù)據(jù)庫對miRNA序列注釋和命名進(jìn)行了系統(tǒng)的修正，miR*命名已經(jīng)終止使用，取而

30、代之的是-5p和-3p的命名法。,74,miRNA的確認(rèn),判斷標(biāo)準(zhǔn): 能夠通過與特定大小的總RNA樣品雜交得到22個堿基對( 22nt)的產(chǎn)物(即需要Northern雜交或引物延伸反應(yīng)驗(yàn)證表達(dá)) 。 所得的序列是從特定大小的( 22nt)的小分子RNA庫中克隆到的,并且必需與克隆的來源物種的基因組序列完全匹配。 經(jīng)過前體的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,有發(fā)夾狀的二級結(jié)構(gòu),并且成熟的miRNA序列在發(fā)夾的一條臂上。 成熟的miRNA序列與預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)在不同物種間有保守性。 在Dicer突變的系統(tǒng)中,前體的積累增多。 要確認(rèn)基因克隆獲得的或生物信息學(xué)分析預(yù)測的基因是否為真正的miRNA,就應(yīng)該采用上面5個原則來

31、檢驗(yàn)。,75,miRNA的檢測方法,要了解miRNA在基因調(diào)控中扮演的角色,很關(guān)鍵的一個方法就是迅速、準(zhǔn)確地定量檢測miRNA基因的表達(dá)。檢測miRNA的方法主要有以下幾種: Northern blotting是現(xiàn)在檢測miRNA表達(dá)最主要的手段,所有克隆和生物信息學(xué)分析得來的miRNA都需要經(jīng)過Northern blotting來驗(yàn)證和確認(rèn)。 這種方法的缺點(diǎn)在于靈敏度較低且不能進(jìn)行高通量的檢測。,76,miRNA的檢測方法,RT-PCR（reverse transcription PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR）也被用來檢測miRNA前體的表達(dá)水平,但miRNA前體的表達(dá)水平并不一定和成熟miRNA的

32、表達(dá)水平一致。因此,在RT-PCR的基礎(chǔ)上,人們改進(jìn)了一些技術(shù),從而使得能夠檢測低表達(dá)量的miRNA。 實(shí)時熒光定量PCR ( real-time PCR)可以很精確的定量分析miRNA的表達(dá),也經(jīng)常用于驗(yàn)證預(yù)測的miRNA。 引物延伸法,就是在引物的5末端加一個特異標(biāo)記,可以定量測定低豐度的RNA含量。 原位雜交技術(shù),可以方便的檢測miRNA的時空表達(dá)的差異。 原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。另有熒光原位雜交。,77,miRNA的檢測方法,芯片技術(shù)(mi-croarra

33、y) 是一種更快、更廣泛、更有前途的研究miRNA表達(dá)的方法。Liu等最先發(fā)表了關(guān)于微點(diǎn)陣能夠獲得高通量的結(jié)果。這些結(jié)果顯示了組織特異性miRNA的表達(dá)標(biāo)記,而且通過Northern blot和real-time PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。 芯片技術(shù)固然以其高通量和并行處理的特點(diǎn)在基因信息分析中占據(jù)重要地位,但信息量大并不等于質(zhì)量高。實(shí)際上,基因芯片的一個突出弱點(diǎn)就是其信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性比較差,且無法實(shí)現(xiàn)定量檢測,因此后來又出現(xiàn)了多種改進(jìn)的芯片技術(shù),其中現(xiàn)在流行的就是液相芯片技術(shù)。 液相芯片( liquichip )是美國納斯達(dá)克上市的Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù),它既能為后基

34、因組時代科學(xué)研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支持,又能提供高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺。,78,miRNA的識別,多個研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，2123個堿基大小、有5端磷酸基和3羥基的RNA片斷，有的實(shí)驗(yàn)室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子 1.篩選一定大小的RNA分子，連接到3和5的適配子(adapters) 2.逆轉(zhuǎn)錄 3.通過PCR擴(kuò)增 4.亞克隆 5.測序。,在分子克隆中指從大片段的克隆中選取特定小片段再克隆/subclone,79,miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數(shù)據(jù)庫查

35、詢進(jìn)行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。 生物信息學(xué)的方法被鑒別出來，已經(jīng)鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。,80,miRNA的靶基因,miRNA的靶基因預(yù)測 miRNA的靶基因檢測 miRNA的生物學(xué)功能,81,miRNA的靶基因預(yù)測,以前,研究miRNA的靶基因依賴于正向遺傳學(xué)方法,包括突變體的產(chǎn)物、變形篩選、定位克隆和miRNA及其靶基因的確認(rèn),如lin24和let27及它們的靶基因的

36、發(fā)現(xiàn)。在果蠅中,miRNA bantam及其靶基因hid的發(fā)現(xiàn)就是正向遺傳學(xué)研究miRNA的經(jīng)典過程。 反向遺傳學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)的方法比正向遺傳學(xué)更優(yōu)越。它主要是由軟件來預(yù)測miRNA的靶基因并為分子實(shí)驗(yàn)提供指標(biāo)，其基本原理是基于miRNA與其靶基因的自然配對。已知miRNA及其靶基因之間的對比和相關(guān)性, lin24、let27和bantam基因的確認(rèn)等都為計算機(jī)程序發(fā)展提供了更多的信息。 計算機(jī)程序預(yù)測方法在植物種屬中運(yùn)用的很成功,而在動物中則不是很成功,這可能是因?yàn)橹参镏械膍iRNA 與其靶基因幾乎完全配對結(jié)合。而在動物中,miRNA與靶基因mRNA通常以不精確的堿基互補(bǔ)配對結(jié)合。,82,

37、miRNA的靶基因預(yù)測,miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA的頻頻發(fā)現(xiàn)相比，miRNA的功能研究相對緩慢。 到目前為止，在發(fā)現(xiàn)的4449多個miRNA中，確定功能的miRNA僅有幾十個。 導(dǎo)致miRNA功能研究進(jìn)展緩慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶標(biāo)難以確定。 通過實(shí)驗(yàn)方法確定miRNA的作用靶標(biāo)非常耗時，目前尚無高通量的靶標(biāo)鑒定方法。 因此，通過理論方法預(yù)測miRNA的作用靶標(biāo)成為當(dāng)前識別miRNA作用靶標(biāo)的較為理想的途徑。以下重點(diǎn)介紹幾種經(jīng)典預(yù)測軟件的算法分析，其他軟件（見下表）：,83,miRNA幾種常見的預(yù)測方法,下面概括介紹幾種常見的預(yù)測方法： ()

38、miRanda. miRanda 是最早的一個利用生物信息學(xué)對miRNA 靶基因進(jìn)行預(yù)測的軟件, 由Enright等人于2003 年設(shè)計開發(fā). 其對3UTR 的篩選依據(jù)主要是從序列匹配、miRNA 與mRNA 雙鏈的熱穩(wěn)定性以及靶位點(diǎn)的保守性三個方面進(jìn)行分析. miRanda 軟件首先選取了黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中已知的73 條miRNA 作為探針, 采用類似于Smith-Waterman 的算法對9805 個3UTR 進(jìn)行堿基互補(bǔ)分析. 首先, 互補(bǔ)參數(shù)被設(shè)定為: GC, AU 為+5, GU 為+2, 其他配對方式為3, 同時起始空位(gap-openi

39、ng)罰分為8, 延伸空位(gap-extension)罰分為2; *序列比對就是通過一定的算法對兩個或多個序列進(jìn)行比較,找出序列間最大的相似性匹配。*Smith 最后, miRNA 與靶mRNA 的互補(bǔ)還要遵循以下4 個規(guī)則: miRNA 第24 位堿基和靶基因精確匹配; 第312 位堿基和靶基因錯配不得多于5 個; 9L-5(L 為miRNA 總長)位堿基最少一個錯配; 最后5 個堿基錯配不得多于2 個.,85,miRanda,在熱穩(wěn)定性方面, miRanda 采用Vienna 軟件包計算miRNA 與3UTR 作用的自由能(G). 在物種間保守性方面, 要求靶位點(diǎn)在多物種3UTR 比對中

40、相同位置處堿基相同. 綜合以上3 條原則, miRanda 選取每條miRNA相對的3UTR 中排名前10 位的基因, 作為miRNA的候選靶基因, 對于多個miRNA 對應(yīng)于同一靶位點(diǎn)的情況, miRanda 則使用貪心算法(Greedy Algorithm)選取其中得分最高且自由能最低的那一對.,86,TargetScan,() TargetScan 和TargetScanS. TargetScan 是Lewis 等人在2003 年開發(fā)的一款用于預(yù)測哺乳動物miRNA靶基因的軟件, 該軟件將RNA 間相互作用的熱力學(xué)模型與序列比對分析相結(jié)合, 預(yù)測不同物種間保守的miRNA 結(jié)合位點(diǎn). 與

41、miRanda 不同, 在TargetScan 的算法中, 要求miRNA5端第28 位堿基與mRNA 的3UTR 完全互補(bǔ), 這7 個核苷酸被稱作“miRNA 種子區(qū)/關(guān)鍵區(qū)”（seed region）. 種子區(qū)向兩側(cè)延伸直到出現(xiàn)堿基錯配為止, 這期間允許GU配對, 同時利用RNAFold 計算結(jié)合位點(diǎn)的自由能. TargetScan 中引入了信號噪聲比來評估預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確度, 所謂信號噪聲比即用已知(信號組)和隨機(jī)生成的miRNA(噪聲組)分別對mRNA 的3UTR 進(jìn)行預(yù)測, 所得靶基因數(shù)目的比值.,87,當(dāng)僅針對人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的3UTR

42、 對miRNA 靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測時, 信號噪聲比為21 針對人、小鼠、大鼠(Rattus norvegicus)的3UTR 進(jìn)行預(yù)測時信號噪聲比為3.21 研究范圍擴(kuò)大到人、小鼠、大鼠和河豚(Takifugu rubripes)時, 信號噪聲比為4.61. 隨著物種數(shù)目的增多, 預(yù)測得到的靶基因減少, 但準(zhǔn)確性得到了相應(yīng)的提高.,88,TargetScanS,后來, Lewis 等人又對TargetScan 進(jìn)行了優(yōu)化,即TargetScanS. TargetScanS 在人、小鼠、大鼠的基礎(chǔ)上增加了狗(Canis familiaris)和雞(Gallus gallus)的基因組數(shù)據(jù), 同時在算

43、法上做了改動, 將種子區(qū)由先前的7 個核苷酸調(diào)整為5端第27 位堿基共6 個核苷酸,要求在種子區(qū)完全互補(bǔ)的情況下, miRNA 第8 位堿基與靶基因互補(bǔ)或者miRNA第1 位堿基是腺嘌呤. 2007年, Andrew 等人又將TargetScanS 的算法中加入了新的條件 1）即有效的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)多分布于3UTR 中AU 富集的區(qū)域 2）功能上具有協(xié)同作用的miRNA 靶位點(diǎn)相近 3）miRNA 的第1217 個核苷酸與3UTR 互補(bǔ)促進(jìn)兩者的結(jié)合 4）有效的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)先分布于3UTR 的兩側(cè), 但距離終止密碼子至少15 個核苷酸.,89,動物中靶基因預(yù)測方法,90,擴(kuò)展,

44、miRNA命名 物種縮寫 癌基因和相關(guān)miRNA的特征 基因數(shù)據(jù)庫 Blast簡介 cancer genetics web miRanda應(yīng)用,91,miRNA命名,(1)miRNA簡寫成miR-No.,它的基因簡寫成mir-No. 如miR-21； (2)高度同源的miRNA在No.其后加英文字母(小寫,一般從a開始) 如miR-199a 和miR-199b； (3)由不同染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工而成的具有相同成熟體序列的miRNA，則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)分, 如miR-199a-1和miR-199a-2； (4)如果一個前體的2個臂分別加產(chǎn)生miRNA，則根據(jù)克隆實(shí)驗(yàn)，在表達(dá)水平較

45、低的miRNA 后面加“*” ，如miR-199amiR-199a*，或進(jìn)行如下命名，miR-142-5p(也可命名為miR-142-s，表示從5 端的臂加工而來)和miR-142-3p(也可命名為miR-142-as，表示從3端的臂加工而來)； (5)將物種縮寫置于miRNA之前，如hsa-miR-195； (6)確定命名規(guī)則之前發(fā)現(xiàn)的miRNA，如let-7，則保留原來名字。,92,物種縮寫,http/www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/guidelines.html hsa: Homo sapiens, 人 mmu: Mus musculus, 小家鼠 rno

46、：Rattus norvegicus大鼠 cfa：Canis familiaris 狗 gga：Gallus gallus雞 dan、der、dgr、dme（黑腹果蠅）、dmo、dpe、dps、dse、dsi、dvi、dwi、dya：果蠅（不同種屬）,93,癌基因和相關(guān)miRNA的特征,大量關(guān)于癌癥的相關(guān)研究證實(shí)在癌癥患者體內(nèi)確實(shí)存在著某些異常表達(dá)的miRNA 值得研究的是癌癥患者體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的異常表達(dá)的miRNA幾乎全部作用于癌癥患者的癌基因上 從這個角度看，miRNA在癌癥的發(fā)生過程中，特別是對癌基因的基因調(diào)控，抑制蛋白質(zhì)表達(dá)方面應(yīng)該起著非常重要的作用 因此，研究癌癥與miRNA的關(guān)系具有非

47、常重要的生物學(xué)意義。,94,癌基因和相關(guān)miRNA的特征,癌癥患者體內(nèi)存在的某些與癌癥有密切關(guān)系的蛋白質(zhì)，其出現(xiàn)與癌基因的激活有密切關(guān)系，因此研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域與miRNA的關(guān)系也非常有意義。 目前研究的RNAi技術(shù)可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中沉默人類的內(nèi)源性基因，使得RNAi技術(shù)可能進(jìn)入腫瘤治療領(lǐng)域。利用RNAi技術(shù)封閉惡性細(xì)胞中的癌基因成為高特異性治療癌癥的新希望。,95,miRNA預(yù)測主要遵循原則,主要遵循以下幾個常用原則: ()miRNA 與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性 ()miRNA 靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性 ()miRNA-mRNA 雙鏈之間的熱穩(wěn)定性 ()miRNA 靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu) (

48、)miRNA 5端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于3端.,區(qū)別：miRNA與mRNA的3端結(jié)合,96,靶基因的檢測方法,目前由于miRNA相關(guān)研究開展時間不長，可以輔助或?qū)崿F(xiàn)miRNA靶基因鑒定的生物實(shí)驗(yàn)方法種類不多，總結(jié)起來主要有： DNA微陣列實(shí)驗(yàn)（DNA microarray）、 免疫印跡（Western blot）、 報告基因檢驗(yàn)（report gene assay）、 靶位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、 免疫沉淀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（immunoprecipitation，IP）、 蛋白質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)（mass spectrometry）。 與miRNA靶基因的預(yù)測方法相比, 對miRNA靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法并不多, 目前還沒有一個快速、簡便、高通量的鑒定方法.,97,靶基因的檢測方法,最直接的鑒定方法是, 利用熒光定量PCR 及Western blot 方法分別檢測轉(zhuǎn)染(水平升高)或敲低(水平降低)miRNA后細(xì)胞中mRNA 水平及蛋白水平的變化, 從而確定miRNA與靶基因的對應(yīng)關(guān)系. 這種方法能夠直接鑒定