1、RNA-seq技術(shù)原理及應(yīng)用,a,2,主要內(nèi)容,1、RNA-seq技術(shù)簡(jiǎn)介 2、RNA-seq技術(shù)原理 3、RNA-seq結(jié)果分析 4、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,a,3,一、RNA-seq技術(shù)簡(jiǎn)介,1.誕生于 20 世紀(jì) 70 年代的 Sanger 法是最早被廣泛應(yīng)用的 DNA 測(cè)序技術(shù)，也是完成人類基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)。 2. 2005 年以來(lái)，以 Roche 公司的 454 技術(shù)、Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè)序技術(shù)相繼誕生，又稱作深度測(cè)序技術(shù)。 3.把高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到由 RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 上，從而獲得來(lái)自不同基

2、因的RNA 片段在特定樣本中的含量，這就是 RNA測(cè)序或 RNA-seq。,a,4,二、RNA-seq技術(shù)原理,Illumina/Solexa 測(cè)序技術(shù)的基本原理是邊合成邊測(cè)序，即測(cè)序過(guò)程是以 DNA 單鏈為模板，在生成互補(bǔ)鏈時(shí)，利用帶熒光標(biāo)記的 dNTP 發(fā)出不同顏色的熒光來(lái)確定不同的堿基。 新加入 dNTP 的末端被可逆的保護(hù)基團(tuán)封閉，既保證單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，又能在該堿基讀取完畢后，將保護(hù)基團(tuán)除去，使得下一個(gè)反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行。為了增加熒光強(qiáng)度，使之更易被成像系統(tǒng)所采集，該技術(shù)在測(cè)序之前還需要對(duì)待測(cè)片段做橋式擴(kuò)增。,a,5,Shot Gun文庫(kù)構(gòu)建,簇序列讀取反應(yīng),圖像獲得和處理,序列

3、組裝和比較,3,T T T T ,T G C T ,二、RNA-seq技術(shù)原理,a,6,二、RNA-seq技術(shù)原理,RNA-seq實(shí)驗(yàn)流程圖,a,7,為了便于測(cè)序數(shù)據(jù)的發(fā)布和共享，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)以 FASTQ 格式來(lái)記錄所測(cè)的堿基讀段和質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 NCBI、EBI、DDBJ 等數(shù)據(jù)中心建立了大容量的數(shù)據(jù)庫(kù) SRA來(lái)存放共享的測(cè)序數(shù)據(jù)。,三、RNA-seq結(jié)果分析,a,8,三、RNA-seq結(jié)果分析,RNA-seq 數(shù)據(jù)的基本處理,a,9,1. 序列定位算法 （1）空位種子索引法：首先將讀段切分，并選取其中一段或幾段作為種子建立搜索索引，再通過(guò)查找索引、延展匹配來(lái)實(shí)現(xiàn)讀段定位 ，通過(guò)輪換種子考慮

4、允許出現(xiàn)錯(cuò)配的各種可能的位置組合（Maq）。 （2） Burrows-Wheeler 轉(zhuǎn)換技術(shù)：通過(guò)B-W 轉(zhuǎn)換將基因組序列按一定規(guī)則壓縮并建立索引，再通過(guò)查找和回溯來(lái)定位讀段，在查找時(shí)可通過(guò)堿基替代來(lái)實(shí)現(xiàn)允許的錯(cuò)配（Bowtie）。 （3）改進(jìn)的 SmithWaterman 動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法：隨著讀長(zhǎng)的增加，允許讀段序列中存在插入刪除(indel)的定位（BFAST、SHRiMP、Mosaik）。,三、RNA-seq結(jié)果分析,a,10,2. 基因表達(dá)水平估計(jì) RNA-seq 數(shù)據(jù)最基本的應(yīng)用是檢測(cè)基因的表達(dá)水平 ，與基因芯片數(shù)據(jù)相比 ，RNA 測(cè)序得到的是數(shù)字化的表達(dá)信號(hào)，具有靈敏度高、分辨率高

5、、無(wú)飽和區(qū)等優(yōu)勢(shì)。 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)是對(duì)提取出的 RNA 轉(zhuǎn)錄本中隨機(jī)進(jìn)行的短片段測(cè)序，如果一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的豐度高，則測(cè)序后定位到其對(duì)應(yīng)的基因組區(qū)域的讀段也就多，可以通過(guò)對(duì)定位到基因外顯子區(qū)的讀段計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)基因表達(dá)水平。,三、RNA-seq結(jié)果分析,a,11,3. 選擇性剪接事件識(shí)別和剪接異構(gòu)體表達(dá)水平推斷 只要測(cè)序深度足夠深，就能檢測(cè)到所有轉(zhuǎn)錄本的全部序列，包括來(lái)自剪接接合區(qū)的序列。Tophat 等軟件定位剪接接合區(qū)讀段的策略能標(biāo)定出剪接事件中的兩個(gè)剪接位點(diǎn)：供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)。通過(guò)比較供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的組合，就能識(shí)別選擇性剪接事件。 進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)供體和受體位點(diǎn)的讀段計(jì)數(shù)，結(jié)合外顯子其他區(qū)域

6、的讀段數(shù)據(jù)，還能定量地計(jì)算選擇性剪接事件之間的比例。,三、RNA-seq結(jié)果分析,a,12,三、RNA-seq結(jié)果分析,兩類樣本 RNA-seq 數(shù)據(jù)比較分析的框架,a,13,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,1、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究 利用單堿基分辨率的RNA-Seq技術(shù)可極大地豐富基因注釋的很多方面內(nèi)容, 包括 5/3邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定以及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。RNA-Seq還可對(duì)可變剪接(Alternative splicing)進(jìn)行定量研究。 2、轉(zhuǎn)錄本變異研究 在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、編碼序列多態(tài)性研究等，RNA-seq也具有很大的潛力。,a,14,四、RNA-seq技術(shù)應(yīng)用,3、非編碼區(qū)域功能研究 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的一個(gè)重要方面就是發(fā)現(xiàn)和分析 ncRNA，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)。 4、基因表達(dá)水平研究 RNA-Seq一個(gè)特別強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)是它可以捕捉不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化而無(wú)需對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)化。,a,15