1、2.2 動物細胞工程,生產單克隆抗體等,動物細胞工程常用的技術,動物細胞培養(yǎng),動物細胞核移植,動物細胞融合,是其他動物細胞工程技術的基礎。,為什么要進行動物細胞培養(yǎng)?,一.動物細胞培養(yǎng),如何進行細胞培養(yǎng)?,2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術,從動物機體中取出相關組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。,(一)概念,實驗材料，藥性、毒性檢測，提取細胞分泌物等,原理：細胞增殖,1.進行動物細胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？,P44旁欄,提示：用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質。胃蛋白酶作用的適宜pH約為

2、2，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境pH為7.28.4。多數動物細胞培養(yǎng)的適宜pH為7.27.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細胞培養(yǎng)時的消化。,胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎？為什么？,P44尋根問底,提示：胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。,(二) 動物細胞培養(yǎng)過程,胚胎或幼齡動物的組織器官,細胞懸液,10代細胞,50代細胞,剪碎,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,洗滌、稀釋、分離,原代培養(yǎng),用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質

3、。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.27.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。,比老齡動物的組織細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越強，越容易培養(yǎng)。,動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體,動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，將細胞網絡起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。,貼壁生長 接觸抑制,10代以內，保持正常二倍體核型,傳代培養(yǎng),動物組織塊,細胞懸液,原代培養(yǎng),傳代培養(yǎng),胰蛋白酶處理分散成單個細胞,幼齡動物的器官組織；動物胚胎,細胞貼壁 接觸抑制,原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng),加入培養(yǎng)液,用胰蛋白酶等處理貼壁細胞,適宜條件,不死性細胞

4、,動物細胞生長特點：,細胞貼壁：懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。 要求： 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。 細胞的接觸抑制：當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。,細胞貼壁過程,那么什么是接觸抑制？,接觸抑制：細胞在貼壁生長過程中，隨著細胞分裂，數量不斷增加，最后形成一個單層，此時細胞間相互接觸，細胞分裂和生長停止，數量不再增加。,接觸抑制,動物細胞生長特性,部分細胞突變，獲得不死性，向癌細胞方向發(fā)展，糖蛋白減少。,二、動物細胞培養(yǎng)條件,1、無菌、無毒的環(huán)境 （無菌處理，添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液） 2、充足

5、的營養(yǎng)供應 （合成培養(yǎng)液，葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。） 3、適宜的溫度和PH 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4 4、氣體環(huán)境： O2和CO2（95%空氣和5% CO2維持培養(yǎng)液的pH ）,保證細胞順利的生長增殖,思考：動物血清的作用？,主要是：提供有利于細胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質等。,動物細胞培養(yǎng)液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清等。,（1）液體培養(yǎng)基,（2）含有動物血清,動物體細胞大都生活在液體的環(huán)境,植物組織培養(yǎng)呢？,無機鹽、蔗糖 、維生素、生長調節(jié)物質、植物激素,成分比較：,對比：動物細胞培養(yǎng)、植物組

6、織培養(yǎng),.,.,細胞全能性,細胞有絲分裂,固體,營養(yǎng)物質,激素,液體,營養(yǎng)物質,血清等,完整植株,細胞群或細胞產物,無,有,有,無,植物組織培養(yǎng)技術是植物細胞工程技術的基礎。 動物細胞培養(yǎng)技術是動物細胞工程技術的基礎。,復習植物細胞工程和動物細胞工程的部分內容。,P47最上面 1、大規(guī)模的生產生物制品。 2、培養(yǎng)的動物細胞作為基因工程的受體細胞。 3、檢測判斷物質的毒性。 4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于 等，為 及其他疾病提供理論依據。,(四) 動物細胞培養(yǎng)技術的應用,篩選抗癌藥物,治療和預防癌癥,1 關于動物細胞培養(yǎng)的有關敘述中正確的是 A細胞的癌變發(fā)

7、生于原代培養(yǎng)向傳代培養(yǎng)的過渡過程中 B動物細胞培養(yǎng)液中通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、生長素和動物血清 C動物細胞培養(yǎng)的目的只是獲得大量的細胞分泌蛋白 D動物細胞培養(yǎng)前和培養(yǎng)過程中都需要用胰蛋白酶處理,D,相互接觸,接觸抑制,單層,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性,降低,減少,活細胞的膜具有,選擇透過性，大分子染料不能進入細胞，故不染色。,中,低溫,新陳代謝,酶,抗原,二.動物細胞核移植技術和克隆動物,將動物的一個細胞核，移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成為一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體（克隆動物）,分 類,細胞分化程度低，恢復全能性容易,細胞分化程度高，恢復全能性

8、不容易,(一)、 動物細胞核移植概念：,(二)、體細胞核移植的過程：,請看教材P48圖2-21,思考： 1.核移植的受體細胞是什么？處在什么時期？用此細胞作為受體細胞有什么好處？ 2.通過什么手段激活受體細胞，構建重組胚胎？,M中期卵母細胞,誘導方法：物理或化學方法激活受體細胞，完成 細胞分裂和發(fā)育進程。,卵母細胞體積大，便于操作；含有營養(yǎng)物質豐富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)；含有激活細胞核體現全能性的物質。,胚胎 移植,體細胞核移植過程 （體細胞克隆動物）,物理方法：電脈沖等。 化學方法：鈣離子載體、乙醇、蛋白酶合成抑制劑等,整個過程用了哪些技術？ 細胞培養(yǎng)、核移植、胚胎移植 新生牛的性別、

9、基因？ 與供體相同 繁殖方式？ 無性繁殖 原理？ 動物細胞核的全能性,(二)、體細胞核移植的過程：,母綿羊A,母綿羊B,新的卵細胞發(fā)育成早期胚胎,核移植,胚胎移植,體細胞核移植技術,克隆羊,遺傳物質來自：,供體細胞 細胞核A 卵母細胞 細胞質B,步驟一：從一只6歲芬蘭多塞特白面母綿羊（姑且稱為A）的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細胞逐漸停止分裂，此細胞稱之為“供體細胞”； 步驟二：從一頭蘇格蘭黑面母綿羊（B）的卵巢中取出未受精的卵細胞，并立即將細胞核除去，留下一個無核的卵細胞，此細胞稱之為“受體細胞” 步驟三：利用電脈沖方法，使供體細胞和受體細胞融合，最后形成“融合細胞”。

10、電脈沖可以產生類似于自然受精過程中的一系列反應，使融合細胞也能像受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成“胚胎細胞”； 步驟四：將胚胎細胞轉移到另一只蘇格蘭黑面母綿羊（C）的子宮內，胚胎細胞進一步分化和發(fā)育，最后形成小綿羊-多莉。 換言之，多莉有3個母親：基因母親，提供基因組；線粒體母親，提供去核卵細胞；代孕母親，將多莉生下來。有意思的是雖然有三個母親但多莉沒有父親。,P49討論：,1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？,為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質全部 來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在 供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將 受體細胞的遺傳

11、物質去掉或將其破壞(P49小資料）。,培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至1050代左 右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞 遺傳物質可能會發(fā)生突變，而10代以內的細胞 一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細 胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基 礎，通常采用傳代10代以內的細胞。,2.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內的細胞，想一想，這是為什么？,3.你認為用上述體細胞核移植方法生產的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？,核移植動物的核DNA來自于供體細胞，質DNA（線粒體DNA）來自于卵母細胞。,此外，即便動物的遺傳基礎完全相同，但動物的 一些行為、習性的

12、形成與所處環(huán)境有很大關系， 核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境 不會完全相同，其形成的行為、習性也不可能和 核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物 不會是核供體動物100%的復制。,(三)、體細胞核移植技術的應用前景：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進程,2、保護瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領域生產醫(yī)用蛋白質及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和 衰老過程；追蹤研 究疾病的發(fā)展過程 和治療疾病,定向誘導,培養(yǎng)液中加入分化誘導因子： 牛黃酸、丁酰環(huán)腺苷酸,(四)、體細胞核移植技術存在的問題：,研究方面：克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易

13、出現早衰等問題。這些問題尚在研究中。 應用上：生產克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應用還有一定距離。,思考與探究,1.幼齡與老齡動物的組織細胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？,提示：細胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關系，細胞的增殖能力與供體的年齡有關，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細胞比老年動物的組織細胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細胞的分化程度越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。,思考與探究,2.動物細胞培養(yǎng)要經過脫分化的過程嗎？為什么？,動物細胞培養(yǎng)不需經過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)

14、育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。,1.用動、植物成體的體細胞進行離體培養(yǎng)，下列敘述正確的是 A都需用培養(yǎng)箱 B都須用液體培養(yǎng)基 C都要在無菌條件下進行 D都可體現細胞的全能性,C,鞏固練習：,外界條件適宜，植物細胞不需要。動物細胞培養(yǎng)一般需要培養(yǎng)箱。,2、下列屬于動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)主要區(qū)別的是 A.培養(yǎng)基成分不同 B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能 D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞

15、只能培養(yǎng)成植株,A,3、動物細胞工程技術的基礎是 A.動物細胞融合 B.單克隆抗體 C.胚胎移植 D.動物細胞培養(yǎng),D,愈傷組織條件適宜可以傳代培養(yǎng)不分化。,4、細胞株的特點是 A遺傳物質沒有改變，可以無限傳代 B遺傳物質發(fā)生改變，不可無限傳代 C遺傳物質沒有改變，不可無限傳代 D遺傳物質發(fā)生改變，且有癌變特點，可以無限傳代 5、在動物細胞培養(yǎng)中有部分細胞可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱之為: A原代培養(yǎng) B傳代培養(yǎng) C細胞株 D細胞系,C,D,6、用于動物細胞培養(yǎng)的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞 A.容易產生各種變異 B.具

16、有更強的全能性 C.取材十分方便 D.分裂增殖的能力強,D,7.（09江蘇）下圖是一個新生小鼠的肝臟小塊培養(yǎng)裝置示意圖。請回答下列問題。 （1）肝臟切成小薄片，這有利于肝臟細胞 。 （2）氣室中充入5C02：氣體的主要作用是 。 （3）培養(yǎng)液中添加抗生素是為了抑制細菌生長，但要注意選擇抗生素的 ，以保證抗生素對肝臟無害。,吸收氧氣和營養(yǎng)物質、排出代謝廢物,維持培養(yǎng)液適宜的pH,種類和劑量,08年寧夏卷回答下列有關動物細胞培養(yǎng)的問題： 在動物細胞培養(yǎng)的過程中，當貼壁細胞分裂生長到細胞表面 時，細胞會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的 。此時，瓶壁上形成的細胞層數是 ，要使貼壁的細胞從瓶壁上分離下來

17、，需要用酶處理，可用的酶是 。 隨著細胞傳代次數的增多，絕大部分細胞分裂停止，進而出現 的現象；但極少數細胞可以連續(xù)增殖，其中有些細胞會因遺傳物質發(fā)生改變而變成 細胞，該種細胞的黏著性 ，細胞膜表面蛋白質（糖蛋白）的量 。,相互接觸,單層,胰蛋白酶,衰老甚至死亡,接觸抑制,不死性,降低,減少,檢查某種毒物是否能改變細胞染色體的數目，最好選用細胞分裂到 期的細胞用顯微鏡進行觀察。 在細胞培養(yǎng)過程中，通常在 條件下保存細胞，因為在這種條件下，細胞中 的活性降低，細胞的 速率降低。 給患者移植經細胞培養(yǎng)形成的皮膚組織后，發(fā)生了排斥現象，這是因為機體把移植的皮膚組織當作 進行攻擊。,中,冷凍,酶,新陳

18、代謝,抗原,動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的重要區(qū)別在于 A、培養(yǎng)基不同 B、動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C、動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能 D、動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能 培養(yǎng)成植株,鞏固練習,A,動物細胞工程技術的基礎是 A、動物細胞融合 B、胚胎移植 C、動物細胞培養(yǎng) D、核移植,鞏固練習,在動物細胞培養(yǎng)過程中遺傳物質發(fā)生改變的細胞 是 A、細胞系 B、細胞株 C、原代細胞 D、傳代細胞,C,A,下列不屬于克隆的是 A、生物體通過體細胞進行的無性繁殖 B、將某腫瘤細胞在體外培養(yǎng)繁殖成一個細胞系 C、扦插和嫁接 D、將雞的某個DNA片段整合到小鼠的DNA中,鞏固練習,D

19、,植物體細胞雜交的結果是 A、產生雜種植株 B、產生雜交細胞 C、原生質體的融合 D、形成愈傷組織,鞏固練習,A,植物體細胞雜交的目的是 A、產生雜種植株 B、產生雜交細胞 C、原生質體的融合 D、形成愈傷組織,A,植物體細胞雜交可以解決不同生物之間 的問題 A、親緣關系遠 B、地理隔離 C、生殖隔離 D、組織分化,鞏固練習,下列細胞中，不具有細胞全能性特點的細胞是 A、心肌細胞 B、神經細胞 C、根的皮層細胞 D、木質部導管細胞,C,D,知識拓展,1.動物細胞培養(yǎng)技術是如何發(fā)展起來的？,1907年，哈里森（Harrison）在無菌條件下用淋巴液作培養(yǎng)基，培養(yǎng)蛙胚神經組織存活數周，并觀察到神經

20、細胞突起的生長過程，由此創(chuàng)建了蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法，奠定了動物組織體外培養(yǎng)的基礎。之后，又有人將懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，提高了傳代效率并減少了污染。1923年，卡雷爾（Carrel）設計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴大了組織生存空間。 1951年， 厄爾 （Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動物細胞的人工合成培養(yǎng)基。1951年，波米拉（Pomerat）設計了灌流小室，使細胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中，便于作顯微攝影和細胞代謝的研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技術進一步提高了細胞懸浮培養(yǎng)的效率。1957年，杜爾貝科（Dulbecco）等人采用胰蛋白酶消化處理和應用液體培養(yǎng)基的方法，獲得了單層細胞培養(yǎng)。單層培養(yǎng)法的出現，對組織培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動作用。此后單層培養(yǎng)成為組織培養(yǎng)普遍應用的技術。20世紀60年代后，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術開始起步，并逐步發(fā)展。20世紀80年代后，隨著基因工程和其他細胞工程技術的發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術已成為轉基因技術、生物制藥及其他許多技術的基礎，在現代生物技術中發(fā)揮著重要的作用。,知識拓展,2.為什么動物細胞要分散成單個細胞培養(yǎng)？用酶消化的是什么物質？,細胞原代培養(yǎng)時可以分散成單個細胞培養(yǎng)，也可以用細胞群（團）、組織塊培養(yǎng)，經傳代