1、實驗一 免疫沉淀類反應(yīng),遼寧醫(yī)學(xué)院附屬一院檢驗科 王彩紅,免疫沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在溶液或凝膠中接觸形成肉眼可見的抗原抗體復(fù)合物沉淀稱為免疫沉淀反應(yīng)。,沉 淀 反 應(yīng),環(huán)狀沉淀反應(yīng),絮狀沉淀反應(yīng),瓊脂擴(kuò)散試驗,單向擴(kuò)散試驗,電 泳 技 術(shù),火箭免疫電泳,對流免疫電泳,雙向擴(kuò)散試驗,一、雙向免疫擴(kuò)散試驗,指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)散，彼此相遇，在濃度比例適當(dāng)處形成沉淀線。 根據(jù)沉淀線的有無、形狀和位置對抗原或抗體進(jìn)行定性分析，也可用于抗體的半定量檢測 本次實驗利用此原理進(jìn)行抗體效價的測定,實驗原理,A,B,C,試劑與器材,抗體：兔抗人全血清 抗原：人血清 10-15g/L

2、 瓊脂（以生理鹽水配制） 載玻片、打孔器、微量進(jìn)樣器 37水浴箱,制板 取加熱融化的鹽水瓊脂約4ml，均勻澆在水平放置的載玻片上，使成厚度約為1.5mm的瓊脂板，待冷凝。 打孔 打梅花孔（如圖），各孔間的距離為4-5mm。,實驗步驟,倍比稀釋抗體 （見下表） 加樣 用微量加樣器分別取抗原、抗體10ul加入各孔。中央孔加10ul抗原，周圍6孔分別加不同稀釋度的抗體。 溫育 將玻片放在濕盒中，37溫育24h，觀察沉淀線。,在抗原和抗體孔之間會看到白色的沉淀線，將出現(xiàn)白色沉淀線的抗體最高稀釋孔作為該抗體的效價。,結(jié)果判斷,應(yīng)用,檢測未知抗原或抗體 抗原性質(zhì)分析 抗體效價滴定 抗原或抗體純度鑒定,玻片

3、要清潔，邊緣無破損。 澆制瓊脂板時要均勻、無氣泡。 孔要打得圓整光滑，邊緣不要破裂，底部勿與載玻片脫離。 加樣時應(yīng)盡量避免氣泡或加到孔外，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。 反應(yīng)時間要適宜，時間過長，沉淀線可解離而導(dǎo) 致假陰性、不出現(xiàn)或不清楚。,注意事項,對流免疫電泳是將雙向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的一種技術(shù)。 在pH8.6的緩沖液中，抗原帶負(fù)電荷，向正極移動；抗體在電滲作用下向負(fù)極移動。在兩者相遇的最適比例處形成白色沉淀線。,實驗原理,二、對流免疫電泳,抗原：人全血清 抗體：兔抗人全血清 1瓊脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥緩沖液配制 電泳槽、電泳儀、 載玻片、水浴箱、打孔器、微量加樣器,試劑和器材

4、,制板 取已經(jīng)融化的1%瓊脂約4ml，加到水平放置的載玻片上，使成厚度約為1.5mm的瓊脂板，待冷凝。 打孔 用打孔器打孔，孔徑3mm，兩孔間隔4-5mm。（如下圖所示）,實驗步驟,加樣 用微量加樣器分別取10vl抗原、抗體，按圖加樣。,+,Ag,Ab,生理鹽水,電泳 將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)（抗原端放陰極側(cè)，抗體端放陽極側(cè)），兩端貼上用電泳液浸濕的紗布。通電，調(diào)整電壓為4V/cm長或電流3-4mA/cm寬，電泳30min-1h。,結(jié)果判斷,在黑色背景上方，用散射光多個角度觀察，在對孔之間是否有白色沉淀線出現(xiàn)。 如果沉淀線不清晰，可將瓊脂板放入濕盒于37保溫數(shù)小時，可增強(qiáng)沉淀線的清晰度。,注意事項,加樣時不要起氣泡，勿溢出瓊脂孔。 抗原、抗體的量應(yīng)相近，如抗原量過多， 可造成假陰性結(jié)果