1、1、第四章基因組文庫的構(gòu)建、基因組文庫(genomic library )即基因文庫(genomicbank )是一個(gè)含有生物所有基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆組。 構(gòu)建基因庫時(shí)，首先純化生物的總DNA，用機(jī)械切或酶切成一定大小的片段，連接到適當(dāng)?shù)妮d體(通常噬菌體)，在體外包裝細(xì)菌轉(zhuǎn)染，含有不同DNA片段的重組噬菌體粒子這就是基因庫。 這些DNA片段包含了基因組的所有基因。 2、cDNA文庫(cDNA文庫):克隆的重組cDNA的總和通常存在于細(xì)菌或酵母中。 這些克隆表示從特定種類或器官的所有mRNA中制備的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA克隆) :將cDNA片段安裝在載體上轉(zhuǎn)化細(xì)菌，擴(kuò)大

2、多克隆的過程，最終構(gòu)建cDNA文庫。 3、建庫的目的：1.從復(fù)雜的基因組中分離單拷貝的基因2 .從復(fù)雜總mRNA來源的cDNA庫中分離稀有cDNA克隆。 建庫要點(diǎn)：如何生產(chǎn)足夠數(shù)量的重組DNA應(yīng)注意：1.保證載體DNA和目標(biāo)DNA不被外來DNA序列污染2 .盡可能使用“電話克隆”。 4，5，第一節(jié)DNA克隆片段的產(chǎn)生和分離，1 .基因組DNA的片段1 .用限制酶片段：將DNA消化，不通過凝膠電泳部門，直接連接載體的克隆方法被稱為霰彈槍法(shot-gan approach )的問題根據(jù)每個(gè)載體可以插入13kb的DNA的計(jì)算，基因庫至少包含1030萬個(gè)重組質(zhì)粒。 從其中篩選目標(biāo)基因的工作量非常大

3、。 目的基因內(nèi)部可能有一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，一個(gè)基因載于幾個(gè)重組質(zhì)粒上，進(jìn)行完全篩選更不容易。 6，2 .隨機(jī)分段：可制作超聲波： 300bp的短篇分段。 高速攪拌： 1500轉(zhuǎn)/分30分鐘可以切斷平均長(zhǎng)度為8kb的分子群。 3 .雙酶消化酶消化的產(chǎn)物一般分子大，考慮到噬菌體插入片段不超過25kb，因此選擇識(shí)別4bp的限制酶(切割平均長(zhǎng)256bp )，識(shí)別6bp的限制酶切割平均長(zhǎng)4096 bp . 7 .雙酶切產(chǎn)生的DNA片段的平均大小不超過1kb，但采用雙酶部分消化，產(chǎn)物的分子量可達(dá)到1030kb，它們有時(shí)按照隨機(jī)順序重疊，用蔗糖梯度離心和凝膠電泳可以將這些片段群按大小分開，分子量約2 二.如

4、果DNA片段大小的支部知道目的基因克隆片段的大小范圍，克隆前可以用蔗糖梯度離心或瓊脂糖凝膠電泳將DNA集團(tuán)在大小的支部分離。 三、目的基因克隆片段的豐富性。 8，4 .克隆數(shù)確定，任何DNA序列出現(xiàn)在文庫的概率： N:此序列需要克隆總數(shù)p:克隆的DNA序列在文庫中設(shè)置的出現(xiàn)概率一般為99%； I :克隆DNA片段的長(zhǎng)度，假設(shè)為17kb的G:基因組DNA的全長(zhǎng)，例如人為3109bp、9，將上式=8.1105 N代入數(shù)據(jù)的意思是，克隆大小為17kb的人DNA的情況下，所構(gòu)筑的基因庫10、cDNA文庫、1 .概況： cDNA文庫是通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA制備雙鏈cDNA (雙鏈cDNA )建立的。 構(gòu)建c

5、DNA文庫的策略有： (1)依賴于目標(biāo)mRNA的相對(duì)豐度；(2)篩選方法：除了簡(jiǎn)單的分子雜交法以外，還可以用多種方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。 11、cDNA文庫的優(yōu)點(diǎn)，(1)通過將遺傳物質(zhì)制成RNA病毒，可以制作文庫(2)由于克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組文庫，所以容易篩選(3)從分化特異細(xì)胞的cDNA文庫分離為特異表達(dá)的基因(4)倉庫建設(shè)時(shí)排除其他RNA，降低假陽性率。 (5) cDNA文庫可以在細(xì)菌中表達(dá)，可以用各種策略篩選。 12，但是應(yīng)該注意的是，(1)細(xì)胞內(nèi)不同的mRNA的存在度不同，低存在度的mRNA要求高克隆數(shù)(用公式計(jì)算)。 (2)某些基因表達(dá)具有嚴(yán)峻的時(shí)空性，得到其mRNA并不容易。從不同

6、的發(fā)育階段或不同組織細(xì)胞的mRNA制備的cDNA文庫中包含一些共同和特異的序列。 這可以用于分離差異表達(dá)的基因。 (3)cDNA文庫的DNA中沒有內(nèi)含子、調(diào)節(jié)元件、基因間DNA。 不能用于基因結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的研究。 一個(gè)基因可以通過不同的切斷形成不同部分重疊的cDNA克隆。 制備13，cDNA文庫，分離代表細(xì)胞中的主要tRNA (trna和trna由于其豐富和大小的一致性，可以通過分級(jí)直接分離)。 mRNA的提取可以用胸腺嘧啶柱分離。 被反轉(zhuǎn)。 cDNA的第一鏈合成用oligo(dT )引物可以在中部添加另一種引物，因?yàn)殚L(zhǎng)的mRNA沒有完全轉(zhuǎn)錄。 第二鏈cDNA的合成通過自引物進(jìn)行，更有效的方法之

7、一是在cDNA的第一鏈上添加多胞嘧啶等尾巴，以oligo(G )為引物開始第二鏈的合成。 這樣產(chǎn)生的雙鏈cDNA，通過加合物或均聚尾插入載體。 在第14、15、第二節(jié)構(gòu)建文庫載體，1.噬菌體載體的基礎(chǔ)：裸噬菌體重組DNA轉(zhuǎn)化為宿主細(xì)胞，或包裝后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。 載體篩選：在細(xì)菌苔上形成菌斑。 重組篩選：可見插入載體標(biāo)記的插入失活(通過中斷cI基因阻止溶解性，產(chǎn)生的噬菌體更清晰的現(xiàn)代載體具有l(wèi)acZ基因，用蘭白進(jìn)行篩選。 16、取代載體Spi-表型(對(duì)P2感染失去敏感性)是由中心“填充片段”gam和red基因座的喪失引起的。 施主DNA的大?。翰迦胼d體：0-10kbp； 取代載體：9-23kbp。

8、 插入大小的范圍被限制在有效形成菌斑的野生型基因組的75-105%。 主要應(yīng)用：插入載體：cDNA克隆和表達(dá)庫的噬菌體展示。 取代載體：基因組DNA克隆。 17，2 .粘多糖顆粒(cosmid )載體的基礎(chǔ)：包含噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒； 導(dǎo)入宿主：體外包裝，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的載體篩選：類似于質(zhì)粒重組篩選：可見標(biāo)記插入失活和小片段插入的陽性篩選的施主DNA大?。?30-45kbp。 插入尺寸的范圍被限制在有效形成菌斑的野生型基因組的75-105%。 主要應(yīng)用：基因組文庫的構(gòu)建。 18，19，3 .質(zhì)粒載體構(gòu)建cDNA文庫，20，4 .大容量克隆載體，21，(1)細(xì)菌人工染色體，BACs， fosmi

9、ds )基礎(chǔ)：大腸桿菌f質(zhì)粒導(dǎo)入宿主：轉(zhuǎn)化載體篩選：顯性選擇標(biāo)記重組篩選：插入片段尺寸施主DNA尺寸： 300kbp主應(yīng)用：大基因組分析回顧：低頻重排和嵌合分子。 載體保持每個(gè)細(xì)胞一個(gè)或兩個(gè)拷貝，并生成少量的施主DNA。 22，23，24，(2) P1載體和P1人工染色體(P1 artificial chromosomes，PACs )基礎(chǔ)：噬菌體P1導(dǎo)入宿主：體外包裝和轉(zhuǎn)錄載體篩選：顯性選擇標(biāo)記重組篩選：中斷致死標(biāo)記載體維持低拷貝，但可以通過誘導(dǎo)噬菌體p-1的溶菌酶循環(huán)放大。 25，(3)酵母人工染色體(yeast artificial chromsomes，YACs )基礎(chǔ)：釀造酵母的中心

10、顆粒、端粒和ARS導(dǎo)入宿主：轉(zhuǎn)化酵母原生質(zhì)體篩選：顯性篩選標(biāo)志(營(yíng)養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)) 重組篩選：插入片段大小施主DNA大?。?2000kbp主要應(yīng)用：大基因組分析，YAC轉(zhuǎn)基因小鼠回顧： YAC的缺點(diǎn)是高頻自發(fā)缺失，與克隆嵌合化。 重組載體的大小，需要進(jìn)行電泳分析，有時(shí)很難區(qū)分內(nèi)源性染色體。 YAC維持低復(fù)印。 26、27、第三節(jié)文庫的篩選，一.基因組DNA文庫的篩選DNA文庫是分離目的基因的常用方法，數(shù)千萬的克隆中僅含有極少數(shù)目的基因，而且很多基因的產(chǎn)物沒有可選擇的表型特征(2)用免疫和生化方法檢測(cè)基因產(chǎn)物；(3)用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。28，2.cdna的篩選，(1)最佳cdna文庫的m

11、RNA在細(xì)胞中高水平特異性表達(dá)(2)目的mRNA的豐度極低時(shí)，應(yīng)選擇其豐度相對(duì)高的細(xì)胞構(gòu)建文庫，計(jì)算文庫應(yīng)具有的克隆數(shù)29，30，探針的特異性可以通過以下策略解決：以基因特異性序列為探針長(zhǎng)度在1720Nt以上控制退火溫度。 堿的簡(jiǎn)并性，通過選擇簡(jiǎn)并度最低的序列可以解決選擇使用頻率最高的密碼子簡(jiǎn)并密碼子的第三個(gè)堿為h； 應(yīng)用混合探針控制退火溫度。 31，3 .使用寡核苷酸探針分離目的基因1 .寡核苷酸探針的來源(1)從一種分離的基因序列可以是另一種核酸探針(2)由與蛋白質(zhì)保存區(qū)相鄰的67個(gè)氨基酸導(dǎo)出合成核酸探針。 合成探針時(shí)，必須考慮探針的特異性堿的簡(jiǎn)并性。 32，4 .克服假陽性克隆，使用混合

12、探針分離克隆基因取得了良好的效果，但發(fā)生了相當(dāng)數(shù)量的假陽性。 作為克服假陽性的方法， (1)的“guessmer”探針估計(jì)體探針基于特定種已知蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率，選擇包含密碼子退縮度最低的蛋白質(zhì)的片段并人工合成的低退縮性寡核苷酸探針33、34、推測(cè)體探針只要85%的堿基能量與目的基因配對(duì)就可以雜交。 推測(cè)連續(xù)配對(duì)區(qū)長(zhǎng)(達(dá)到1012Nt )時(shí)，身體的探測(cè)作用強(qiáng)度足以鑒定含有目的基因的陽性克隆。 如果錯(cuò)誤的核苷酸均勻分散在探針分子的各個(gè)部位，該推測(cè)體探針就不與目的基因的序列雜交。 提高雜交溫度減少假陽性。35，(2)PCR推測(cè)體技術(shù)，測(cè)定尿酸氧化酶末端的32aa的序列從該階段的兩側(cè)序列推測(cè)，合

13、成一組引物從豬肝中提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用上述引物特異性擴(kuò)增該cDNA。 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體進(jìn)行克隆，用唯一的推測(cè)體探針進(jìn)行雜交，選擇陽性克隆。 這個(gè)推測(cè)體探測(cè)器用32aa序列導(dǎo)出了推測(cè)。 分離的克隆中部為上述32aa，兩端為引物序列。 以該插入序列為探針，在嚴(yán)格條件下篩選噬菌體cDNA庫。 36、37、5 .用差分雜交或減法雜交方法分離克隆目標(biāo)基因，(1)差分雜交(diffential hybridization) 1.差分雜交必須具有兩個(gè)細(xì)胞組：一個(gè)細(xì)胞組中目標(biāo)基因正常表達(dá)，另一個(gè)細(xì)胞2 .調(diào)制兩種不同的mRNA提取物。 含有一定比例的目的基因mRNA的總mRNA不含另一個(gè)目的基

14、因mRNA的總mRNA； 3 .通過以這兩種總mRNA為探針的平行雜交篩選目標(biāo)基因cDNA克隆文庫。 38、39、(二)減雜交，減少雜交的缺點(diǎn)：(一)靈敏度低(二)再現(xiàn)性差(三)需要大量的雜交膜，工作量多，花費(fèi)時(shí)間，因此可以通過減雜交來篩選，通過減雜交來分析突變基因(41，(三).分離克隆目的基因，DDRT-PCR，42，43，(4)用免疫方法分離克隆的目的基因，1 .用目標(biāo)蛋白質(zhì)制備抗體，2 .用該抗體制備抗體，擴(kuò)大信號(hào)。 3 .標(biāo)記抗體4 .進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。 篩選、44、45、46、6.YAC文庫，理論上分離成大量的基因組克隆，如果構(gòu)建它們的限制圖，就可以識(shí)別重復(fù)的基因組克隆，進(jìn)一步構(gòu)建全基

15、因組的物理圖。 實(shí)際上很難。 (1)重復(fù)片段多，重復(fù)長(zhǎng)度不均衡；(2)工作量多的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)YAC文庫的插入片段的總和相當(dāng)于58個(gè)基因組的大小，需要約500個(gè)96個(gè)孔和相應(yīng)量的雜交瘤。 因此，一般使用Locus- specfic PCR進(jìn)行篩選。按“池”(pool )單位(相當(dāng)于4張96節(jié)流孔)或“超級(jí)成套”(相當(dāng)于96節(jié)流孔20張)依次進(jìn)行篩選，逐漸縮小篩選范圍。 47，7 .基因定位克隆、基因定位克隆(map-based cloning )是分離未知結(jié)構(gòu)的目的基因。 理論上，鑒定的突變基因可以用這種方法分離。 條件是(1)包含該基因的YAC文庫成立；(2)需要與目的基因密切相連的標(biāo)記(已知基因或分子標(biāo)記)。 48、(一).染色體體步進(jìn)法(chromosome walking) (1)方法：人和其他動(dòng)物定位克隆以染色體步進(jìn)法：相鄰標(biāo)記為探針，在基因組文庫中篩選重復(fù)克隆。