1、1,常用細(xì)菌生化反應(yīng),觸酶試驗(yàn) 凝固酶試驗(yàn) 膽汁溶菌試驗(yàn) 氧化/發(fā)酵試驗(yàn) 氧化酶試驗(yàn) 苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) 硝酸鹽還原試驗(yàn) 糖發(fā)酵試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)（靛基質(zhì)試驗(yàn)） 甲基紅試驗(yàn) V-P（Voges-Proskauer）試驗(yàn) 枸櫞酸鹽（或檸檬酸鹽）利用試驗(yàn) 克氏雙糖鐵（KIA）復(fù)合試驗(yàn) 動(dòng)力、吲哚及脲酶（MIU）復(fù)合試驗(yàn),2,原理： 有觸酶的細(xì)菌能催化過氧化氫生成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。,觸酶試驗(yàn),3,方法： 用接種環(huán)取備檢菌少許，置于潔凈的玻片上，滴加3%的過氧化氫12滴，觀察結(jié)果。 試管法：用潔凈的玻棒蘸取待檢菌少許，置于裝有3%過氧化氫的試管內(nèi)，觀察結(jié)果。,觸酶試驗(yàn)方法,4,觸酶試驗(yàn)

2、結(jié)果,應(yīng)用： 用于革蘭陽性球菌初步分屬。 注意事項(xiàng)：,5,血漿凝固酶試驗(yàn),原理： 有些細(xì)菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可以使人和動(dòng)物血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白，從而使血漿凝固。,6,方法： 玻片法：取潔凈玻片一張，加生理鹽水兩小滴于玻片兩端，用接種環(huán)挑取待檢菌落和對(duì)照菌均勻涂于鹽水中，制成濃菌液，加兔或人血漿一滴于菌液中，觀察結(jié)果。 試管法：于3支試管中分別加入1:4稀釋的血漿0.5ml，1支管加入待檢菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml,另兩支分別加陰陽性對(duì)照菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml，35培養(yǎng)34h后觀察結(jié)果。 應(yīng)用：主要用于金葡菌的鑒定。,血漿凝固酶試驗(yàn)方法,7,(-)凝固酶(+),1）凝固酶試驗(yàn) 玻片法測(cè)定

3、結(jié)合型凝固酶；試管法測(cè)定分泌型凝固酶。金黃色葡萄球菌、中間型葡萄球菌呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。路鄧葡萄球菌產(chǎn)生結(jié)合型凝固酶而不分泌游離型凝固酶, 因而玻片凝固酶試驗(yàn)陽性、試管凝固酶試驗(yàn)陰性。 玻片法 少許菌落 + 兔血漿 10 s 內(nèi)出現(xiàn)凝集為陽性,陽性：金葡、中間葡 陰性：其它葡萄球菌,試管法: 試管2支，各加0.5 ml兔血漿，取被檢菌和陽性對(duì)照菌分別加血漿混勻，37 水浴34 h,（3）種的鑒定,(-)商品化的膠乳凝集試驗(yàn)(+),8,原理： 膽鹽、去氧膽酸鈉和硫磺膽酸鈉能選擇性地溶解肺炎鏈球菌，膽汁降低細(xì)胞膜的張力-膜破損或裂解,膽汁溶菌試驗(yàn),9,方法： 平板法：取膽酸鈉溶液一環(huán)，放在平板的菌落上，

4、3530min觀察結(jié)果。 試管法：于0.9ml培養(yǎng)了1824小時(shí)的菌液中，加入取氧膽酸鈉試劑0.1ml或牛膽鹽0.2ml混勻，37水浴1030min，觀察結(jié)果。 應(yīng)用： 主要用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌。,膽汁溶菌試驗(yàn)方法,10,CAMP試驗(yàn),原理： B群鏈球菌能產(chǎn)生一種胞外因子 CAMP,它能增強(qiáng)金黃色葡萄球菌-溶血毒素的活性，因此，在兩菌交界處出現(xiàn)箭頭樣的溶血增強(qiáng)區(qū)。,11,方法： 取血平板一塊，用產(chǎn)生-溶血毒素的金葡菌在中央劃一道線，將待檢菌據(jù)此線0.5cm處垂直劃線。351824小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。 應(yīng)用： 用于鑒定B群鏈球菌。,CAMP試驗(yàn)方法,3）CAMP試驗(yàn),無乳鏈球菌能產(chǎn)生CAM

5、P因子，它可促進(jìn)金黃色葡萄球菌溶血能力，使其產(chǎn)生顯著的協(xié)同溶血作用。本法可作為無乳鏈球菌的初步鑒定試驗(yàn),13,13,涂片：G+C,觸酶試驗(yàn),鏈球菌 腸球菌,+,葡萄球菌、微球菌,標(biāo)本,氧化酶(雙糖), (O),+ (F),微球菌,葡萄球菌,凝固酶試驗(yàn),鑒定流程,+,金葡,表葡、腐生,新生霉素,表葡,腐生,S,R,14,14,觸酶試驗(yàn)：陰性,鏈球菌屬鑒定流程,觀察血平板上溶血環(huán),-溶血環(huán),非-溶血環(huán),Optochin、桿菌肽、 膽七 、高鹽,桿菌肽 、CAMP、 膽七 、高鹽,非溶血鏈球菌鑒定,16,氧化-發(fā)酵試驗(yàn),又稱O/F試驗(yàn)或Hugh-Ldifson（HL）試驗(yàn),17,原理： 細(xì)菌分解葡萄

6、糖對(duì)O2需求不同， 氧化型：細(xì)菌只在有氧環(huán)境中分解葡萄糖; 發(fā)酵型：細(xì)菌可在有氧、無氧環(huán)境中分解G; 產(chǎn)堿型：細(xì)菌在有氧、無氧環(huán)境中都不 分解葡萄糖;,葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn),18,硝酸鹽還原試驗(yàn),某些細(xì)菌能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽-亞硝酸鹽、氨和氮。,原理：,19,原理： 使硝酸鹽還原的細(xì)菌能從硝酸鹽中獲得氧，使其成為亞硝酸鹽或其它還原物。培養(yǎng)基中的亞硝酸基能與-萘氨和苯磺酸形成紅色的N-萘氨偶氮苯磺酸。若出現(xiàn)紅色現(xiàn)象則說明該菌還原硝酸鹽。,硝酸鹽還原試驗(yàn),20,方法： 取一環(huán)待檢菌接種到硝酸鹽瓊脂斜面上，35培養(yǎng)1824小時(shí)，然后依次加入含-萘氨和對(duì)氨基苯磺酸的試劑各1mL，30s后觀察結(jié)果。,

7、硝酸鹽還原試驗(yàn)方法,21,應(yīng)用： 有助于鑒別腸桿菌科、奈瑟菌屬、布蘭漢菌屬、假單胞菌屬等,22,氧化酶試驗(yàn),原理： 某些細(xì)菌具有細(xì)胞色素氧化酶，能將二甲基對(duì)苯二胺或四甲基對(duì)苯二胺試劑氧化成紫紅色醌類化合物,23,方法： 濾紙法：用潔凈濾紙蘸取菌落，加一滴試劑，觀察結(jié)果 菌落法：直接在菌落上加試劑，觀察結(jié)果 紙片法：使用試劑浸泡制成的試劑紙片，取足夠的菌落，觀察結(jié)果。 應(yīng)用：用于科別鑒定試驗(yàn)。,氧化酶試驗(yàn)方法,24,苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn),原理： 有苯丙氨酸脫氨酶的細(xì)菌，可以使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙銅酸與三氯化鐵作用形成綠色化合物。,25,方法： 瓊脂斜面法：將待檢細(xì)菌接種到苯丙氨酸瓊脂斜面

8、上， 35培養(yǎng)2448h，取出，將三氯化鐵試劑45滴滴于斜面上，觀察結(jié)果。 快速紙片法：將待檢菌涂于苯丙氨酸紙片上，孵育15min，取出，滴加三氯化鐵試劑，立即觀察結(jié)果。,苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)方法,26,應(yīng)用：多用于腸桿菌科的鑒定。 變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬和摩根菌屬為陽性。,27,1.糖發(fā)酵試驗(yàn),【原理】： 各種細(xì)菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，對(duì)糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后僅產(chǎn)酸，有的分解后產(chǎn)酸產(chǎn)氣，故可用來鑒別細(xì)菌。 【方法】： 將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種葡萄糖、乳糖發(fā)酵管，35C培養(yǎng)18-24h 觀察結(jié)果。,28,1.糖發(fā)酵試驗(yàn),【結(jié)果】： 首先確定細(xì)

9、菌是否生長，細(xì)菌生長者培養(yǎng)基呈混濁狀： 1）不分解糖，培養(yǎng)基顔色與接種前無變化，以“-”表示； 2）分解糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，以“+”表示； 3）分解糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，除培養(yǎng)基顔色變化外，倒管中還有氣泡，以“”表示。,29,2.吲哚試驗(yàn)（靛基質(zhì)試驗(yàn)）,【原理】：有些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，與吲哚試劑形成紅色化合物。 【方法】：大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，35C18-24h后，加入吲哚試劑數(shù)滴，靜置分層，觀察結(jié)果。 【結(jié)果】：在培養(yǎng)物液面上層呈玫瑰紅色為陽性，不變色者為陰性。,30,31,3.甲基紅試驗(yàn),【原理】：某些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮

10、酸，丙酮酸可進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)，故培養(yǎng)基pH 在4.5以下，加入甲基紅指示劑后呈紅色（陽性）；有些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸進(jìn)一步化為醇、酮等非酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH在6.2以上，加入甲基紅指示劑后呈黃色（陰性）。 【方法】：大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，35C18-24h，加入甲基紅指示劑2-3滴觀察結(jié)果。 【結(jié)果】：紅色為陽性，黃色為陰性。,32,4.V-P（Voges-Proskauer）試驗(yàn),【原理】：某些細(xì)菌分解葡萄糖生成丙酮酸，進(jìn)一步脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境下被氧化成二乙酰，后者與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色胍縮二乙酰，為VP

11、試驗(yàn)陽性。若培養(yǎng)基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反應(yīng)。 【方法】：大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中，35C，24-48h，加入VP試劑甲液和乙液各1滴，充分搖動(dòng)，觀察。 【結(jié)果】：紅色為陽性，若為陰性應(yīng)再培養(yǎng)4h觀察，仍無紅色者為陰性。,33,5.枸櫞酸鹽（或檸檬酸鹽）利用試驗(yàn),【原理】：當(dāng)細(xì)菌可以利用銨鹽作為唯一氮源，同時(shí)檸檬酸鹽為惟一碳源時(shí)，可在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽為碳酸鹽，使培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚藍(lán)由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，培養(yǎng)基不變色（綠色）為陰性。 【方法】：大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基中，35C，24-48h

12、，觀察。 【結(jié)果】：菌苔出現(xiàn)，培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性。細(xì)菌不能生長，培養(yǎng)基不變色（綠色）為陰性。,34,6.克氏雙糖鐵（KIA）復(fù)合試驗(yàn),【原理】：該培養(yǎng)基用酚紅指示劑，在酸性時(shí)呈黃色，堿性時(shí)呈紅色。細(xì)菌如能發(fā)酵乳糖和葡萄糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。如只發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，從而使斜面部分保持原來的紅色；底層由于是在相對(duì)缺氧狀態(tài)下，細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖所生成的酸類物質(zhì)不被氧化揮發(fā)而保持黃色。如細(xì)菌分解蛋白產(chǎn)生硫化氫，則與硫化亞鐵作用生成黑色的硫化鐵，使培養(yǎng)基變黑。,35,6.克氏雙糖鐵（KIA）復(fù)合試驗(yàn),【方法】：將待檢菌接種

13、于克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（底層穿刺，上層斜面劃線），35C，24h，觀察。 【結(jié)果】：發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則上層和底層均呈黃色且有氣泡產(chǎn)生；只發(fā)酵葡萄糖而不發(fā)酵乳糖，則底層變黃，上層仍為紅色。如底層變黑，說明該菌產(chǎn)生硫化氫，生成黑色的硫化鐵沉淀。,36,7.動(dòng)力、吲哚及脲酶（MIU）復(fù)合試驗(yàn),【原理】：培養(yǎng)基為含尿素、蛋白胨的半固體培養(yǎng)基，指示劑為酚紅。具色氨酸酶的細(xì)菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，加入吲哚試劑后，培養(yǎng)基上層的吲哚會(huì)變紅；具脲酶的細(xì)菌能分解尿素產(chǎn)氨，使整個(gè)培養(yǎng)基變堿呈紅色；有動(dòng)力的細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散生長。 【方法】：將大腸埃希菌和普通變形桿菌穿刺線接種于MIU培養(yǎng)基，35C，18-24h，觀察動(dòng)力和脲酶反應(yīng)后，再滴加吲哚試劑。 【結(jié)果】：擴(kuò)散生長為動(dòng)力陽性；滴加吲哚試劑后呈玫瑰紅色為陽性；培養(yǎng)基變紅脲酶陽性。