1、第二章基因工程的酶基礎(chǔ)，第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第二節(jié)DNA結(jié)合酶第三節(jié)DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié)DNA修飾酶第五節(jié)體外核酸酶第六節(jié)單鏈內(nèi)切核酸酶第七節(jié)RNA酶，核酸酶：通過(guò)切斷相鄰兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，核酸分子多核酸鏈中可能發(fā)生水解斷裂的蛋白酶?；靖拍詈蜕飳W(xué)功能，破RNA分子的特定水解，破DNA分子，破DNA(脫氧核糖核酸酶)非特異性酶，基質(zhì)或DNA，核酸分子末端逐個(gè)分解核苷酸的RNA分子，恩切核酸酶在核酸分子中切斷磷酸二酯鍵，分裂稱為小片段所以這些酶叫做工具酶。工具酶，1，限制性-修飾系統(tǒng)2，限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3，2型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4，影響限制性內(nèi)切酶活性的

2、因素5，限制性內(nèi)切酶的DNA消化效果，第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶，限制性內(nèi)切酶，限制性核酸內(nèi)切概念，2 .特性，土產(chǎn)酶主要來(lái)自原核生物，即核酸分子鏈內(nèi)部制造切口的酶。5-P和3-OH的末端形成，自我保護(hù)效果，3 .功能、細(xì)菌限制和修復(fù)系統(tǒng)(R/M系統(tǒng))、1 .源，任何生物都有防御外部物質(zhì)進(jìn)入的機(jī)制，大腸桿菌b，大腸桿菌K，phage (b)，EOP=10-4(限制作用)，EOP=10-4(限制作用)宿主控制的限制和修正被簡(jiǎn)稱為R/M系統(tǒng)。細(xì)菌的R/M系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)相似，可以區(qū)分自己的DNA和外來(lái)的DNA，分解后者。宿主的限制和修正現(xiàn)象，E.O.P斑點(diǎn)形成速度efficiency of platin

3、g，EOP=1，限制性內(nèi)切酶分解侵入細(xì)菌的外源DNA，將其切成小塊。(1)限制，限制效果：實(shí)際上是限制外源DNA的分解和保護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定性的酶。細(xì)菌自身的DNA堿基受甲基化酶甲基化修飾的保護(hù)，不會(huì)被自身限制性內(nèi)切酶識(shí)別切斷。(2)受精(modification)，dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)，GATC腺嘌呤N6位置處的甲基，Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)，(3)與受精系統(tǒng)相關(guān)的三個(gè)基因限制，HSD R:編碼限制焓、HSD M:編碼限制甲基化酶、HSD S:編碼限制焓和甲基化酶的配合表達(dá)，識(shí)別DNA分子的特定部位，在DNA的特定部位

4、進(jìn)行堿甲基化，即起受精DNA作用的雙鏈DNA其作用是與上述兩種酶合作識(shí)別特殊的作用部位。2 .噬菌體是大腸桿菌宿主細(xì)胞k株，b株，1)宿主細(xì)胞甲基化酶，染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護(hù)。2)自身產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的識(shí)別部位-(修飾)，1。大腸桿菌宿主細(xì)胞k株，b株，有自己的限制和修改體系。限制和修改作用的分子機(jī)制，3 .外來(lái)DNA入侵時(shí)，受宿主限制的恩賽拉酶的特定分解-(限制)，4 .由于不完全分解，外來(lái)少數(shù)DNA分子在宿主細(xì)胞繁殖期間被宿主細(xì)胞的甲基化酶轉(zhuǎn)化，但外部不分解。5在接受新宿主細(xì)菌甲基化變異的同時(shí)，失去了轉(zhuǎn)化為原宿主細(xì)菌的標(biāo)記，失去了在原宿主細(xì)胞中的生存能力。基因工程必須采用沒(méi)有

5、限制效果的菌株作為受體。1，限制性-修飾系統(tǒng)2，限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3，II限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4，限制性內(nèi)切酶活性影響因素5，限制性內(nèi)切酶DNA的消化作用，第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶，1973年H . O Smith和d . nanah限制性內(nèi)切酶的命名法，其名稱的第一個(gè)字母和宗名的前兩個(gè)字母組成三個(gè)字母的縮寫(xiě)，意思是宿主細(xì)菌的宗名，構(gòu)成酶的基本名稱。Escherichia coli(Escherichia coli)表示為Eco嗜血流感(Haemophilus influenzae)用Hin說(shuō)。2.如果酶存在于特殊菌株中，將該菌株名稱的第一個(gè)字母貼在基本名稱后，如果酶的編碼基因在

6、噬菌體(病毒)或質(zhì)粒中，則用一個(gè)大寫(xiě)字母標(biāo)記該染色體外的遺傳成分。(如hind: d菌株EcoR I:耐藥性r質(zhì)粒，3 .如果特定菌株有多種限制和修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬文字標(biāo)記在該菌株中發(fā)現(xiàn)特定酶的順序。Hind: d菌株中發(fā)現(xiàn)的第二種酶，4。所有限制性內(nèi)切酶除了上面的名字外，還加上系統(tǒng)的名字。限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)被命名為r，甲基化酶m。例如，R.Hind表示在相應(yīng)甲基化酶的實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常省略R。EcoR I，Escherichia，屬名，Coli，宗名，Ry13，主，號(hào)，宗名的前兩個(gè)字母相同時(shí)，可以使用的宗名的第一個(gè)和第三個(gè)字母之一。目前已確認(rèn)了4種類型的限制日元也是核酸酶。根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別

7、切割特性、催化條件以及是否有修飾酶活性，可以分為，類型。限制性內(nèi)切酶類型，第二，限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割特性，根據(jù)催化條件和修飾酶活性，可以分為類型，用于基因工程，注：SAM是s腺苷蛋氨酸，首先從M.Meselson和R . Yuan 1968年大腸桿菌b組和k菌株中分離出來(lái)。(1)識(shí)別的站點(diǎn)序列，EcoB:TGA(n)8 tgct EcoK:AAC(n)6 gtgc，類型限制存儲(chǔ)模塊的基本屬性，例如EcoB和EcoK。未甲基化的修改后的特定順序。n:指示需要什么樣的核苷酸。ATP、Mg2和SAM(S-腺苷蛋氨酸)，(3)輔助因子在特定識(shí)別部位隨機(jī)切割約10001500 BP的單鏈，不生成特定片段

8、，應(yīng)用不多，Recognize site，cut，分離的第一種酶是Hind未甲基化的修改后的雙鏈DNA中的特殊目標(biāo)序列(大部分是回文序列)，與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。A B N B A，A B N B A，或限制土衛(wèi)二的基本特性，(1)標(biāo)識(shí)站點(diǎn)序列，標(biāo)識(shí)站點(diǎn)位置。切割雙股DNA。形成“粘性末端”(sticky end)或“平面末端”(blunt end)。例如，(2)剪切部分，a g c t，t c g a，ecop 1: aga cc、ecop 15: CAG很少用于基因工程工作。類型限制恩多核酸酶的基本特性，IV限制恩多核酸酶。堿僅切斷甲基化、羥甲基化、葡萄糖羥甲基化DNA序列。除EcoKMcr

9、BC外，標(biāo)識(shí)序列尚未確定，當(dāng)前尚未應(yīng)用。，核酸限制性內(nèi)切酶的類型和主要特性，1，限制性-修飾系統(tǒng)2，限制性核酸內(nèi)切酶的命名和類型3，2型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4，影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5，對(duì)DNA的限制性內(nèi)切酶的消化，第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶，識(shí)別序列，4bp HPA c CGG hae gg cc 5b pava g gwcc ecor CCW gg 6bp bamhg gattc smaccc GGG 11bp bg1 gcc nnnn nggc 12bp bstx ccan nnnn ntgc，1，以一對(duì)核苷酸為中心軸，左側(cè)和左側(cè)2，如果把這兩條DNA鏈讀在同一方向(例如5 3)，

10、那么核苷酸的順序是相同的。5GAA TTC3 3CTT AAG5，2:回文順序：反向重復(fù)順序，雙鏈DNA中包含相同結(jié)構(gòu)的兩個(gè)相反方向序列，5GTNAC3 3CANTG5，限制性核酸內(nèi)切酶切斷雙鏈DNA，磷酸二酯鍵中3位數(shù)酯鍵的歌手，切割方法，與2型核酸內(nèi)切相關(guān)的一些概念，粘性末端：是酶切割部位在兩個(gè)DNA單鏈上由不同(對(duì)稱)酶切割部位形成的互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，通過(guò)酶產(chǎn)生的兩個(gè)粘性互補(bǔ)堿基對(duì)可以很容易地重新連接。“平端”(Blunt end):是酶切部位在兩條DNA單鏈上相同，因此在酶切后形成的平端結(jié)構(gòu)，該端不易重新連接。1 .5擠出終點(diǎn)，2。3擠出端，I)其他DNA雙鏈：只需連接粘性端基本

11、互補(bǔ)。比連接兩個(gè)平端容易得多。粘性末端的意思，便利的連接，ii)在同一DNA分子內(nèi)的連接：可以通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端連接成環(huán)狀分子。粘性末端可以用DNA聚合酶制造平端。通過(guò)末端過(guò)渡酶可以添加多個(gè)多核苷酸的尾部(如dA和dT)，B 3末端可以由均聚物和尾部人工粘著。A 5端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。顯示末端，3 .只有1%的平頭端、平頭端特征、連接困難、連接效率低、粘性端連接效率高，這種連接經(jīng)常出現(xiàn)多連接連接。粘性末端和扁平末端連接處理方法，)添加方法：使用DNA聚合酶(klenow fragment)將堿基添加到目標(biāo)基因的粘性末端。)薩克(平)方法使用諸如S1和Bal31的核酸酶，

12、在目標(biāo)基因粘著端切割單股突起，以識(shí)別平端、不同來(lái)源的酶、相同序列，以相同的方式切割或不同地切割。識(shí)別部位和觸點(diǎn)完全相同Hind和hsu I，Hind 5-AAG CTT-3-TTC GAA-5 hsu I 5-AAG CTT-3-TTC GAA-5，Isoschizomer，完全相同Xma I和Sma I。不完整的異煙肼：識(shí)別的順序不同，但可以切割相同的粘性末端。5-gg ATCC-3-cc tagg-5、bamh I、bcl I、5-TG atca-3-acta gt-5，如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho等y表示笛米丁。isocaudamers，5-gatc - 3 - ctag-

13、5，sau 3a，同一尾酶的粘端相互結(jié)合形成的新部位，一般不再被識(shí)別為原酶。5-g 3-cctcag、ga TCT-3 a-5、bamh I、bgl、5-gg atct-3-cc taga-5、bamh I、bamh標(biāo)準(zhǔn)酶水解系統(tǒng)的建立，1個(gè)單位(u)的限制性內(nèi)切酶的定義：在適當(dāng)?shù)臏囟群途彌_液中，1h完全酶水解1gDNA所需的酶量。推薦：稍微過(guò)剩的酶(2-5倍)，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件，2。通過(guò)酶解過(guò)程、酶解系統(tǒng)混合反應(yīng)，結(jié)束酶解結(jié)果識(shí)別，將總反應(yīng)體積最小化，只要酶解系統(tǒng)、一般20l、酶解液體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的10%。樣品順序一般是ddH2O buffer DNA酶，大部分2

14、型核酸內(nèi)質(zhì)酶需要類似的反應(yīng)條件：混合，吸管吹制或手指經(jīng)膽管壁，如果基質(zhì)分子大(例如基因組DNA)，應(yīng)避免強(qiáng)烈震動(dòng)。混合微高速離心機(jī)，施加短暫的瞬態(tài)離心力，使管壁液體全部下沉。反應(yīng)終止，三種方法：)加乙二胺四乙酸(EDTA)全濃度10mol/l；十二烷基硫酸鈉(SDS)的總濃度為0.1%(W/V)，65加熱20min或70加熱10min，)苯酚/氯仿萃取，酶水解結(jié)果確認(rèn)，微瓊脂糖凝膠電泳快速觀察后，決定反應(yīng)是否結(jié)束，限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)局部消化：只切除了有限數(shù)量的酶部位?？s短保溫時(shí)間，降低反應(yīng)溫度或減少酶用量，達(dá)到局部消化目的。酶切后發(fā)現(xiàn)，除了目的DNA條外，還存在其他引起非特異性切的條；錯(cuò)誤的操作導(dǎo)致了其他日元也有核酸酶污染。氣質(zhì)DNA可能有其他DNA污染。電泳后電泳條擴(kuò)散，電泳條移動(dòng)距離異常，基質(zhì)DNA不純；恩多紐克萊亞澤不純；酶蛋白本身或其他雜蛋白與DNA結(jié)合，電泳帶異常遠(yuǎn)地移動(dòng)，蛋白質(zhì)、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等DNA中的雜