1、體外培養(yǎng)的原理與技術(shù) 薛慶善 主編,廣西醫(yī)科大學(xué)組胚教研室 何少健,電話0771-5358577(辦),2020/7/8,1,課 程 安 排 及 進(jìn) 度,2020/7/8,2,實驗課時間：從第14周開始 實驗課地點：104館三樓東邊,注意事項： 1.網(wǎng)上沒有名字的 同學(xué)請不要填報實 驗課名單。 2.現(xiàn)在不能確定 自己時間的同學(xué) 不要填報，可以 下次上課時再報。 3.一旦填報就不能 再更改時間。,2020/7/8,3,體外培養(yǎng)的基本原理與技術(shù),一、從體內(nèi)生存環(huán)境到體外生長條件,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,三、體外培養(yǎng)物的生長生物學(xué),四、細(xì)胞分離與純化,五、細(xì)胞系（株）

2、、細(xì)胞克隆,六、培養(yǎng)物的觀察檢測方法,2020/7/8,4,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,植塊（explant） ： 從動物體內(nèi)取出，用于培養(yǎng)的小塊組織一般稱為外植塊或簡稱植塊。 分離（散）細(xì)胞isolated（dissociated）cell： 由組織塊分散后制成的單個細(xì)胞一般稱之。 細(xì)胞懸液（cell suspension）： 單個細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或者其它平衡鹽溶液、緩沖溶液中，就稱之 。,幾個名詞和概念：,2020/7/8,5,當(dāng)培養(yǎng)物的總體積不斷擴大，培養(yǎng)過程持續(xù)到一定的時候，原先的培養(yǎng)器皿已不能滿足培養(yǎng)物的空間要求，這時就需要將培養(yǎng)物分成若干小的部分，繼續(xù)培養(yǎng)。 因此，按照培養(yǎng)過

3、程中培養(yǎng)物是否需要被分割后再培養(yǎng)，而將體外培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)或稱初代培養(yǎng)（primary culture）和繼代培養(yǎng)（secondary culture)或稱再培養(yǎng)（subculture）兩大類。,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,幾個名詞和概念：,2020/7/8,6,（二）繼代培養(yǎng),（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇,（五）培養(yǎng)物的污染,（一）原代培養(yǎng),二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2020/7/8,7,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,原代培養(yǎng)，通俗地講，就是第一次培養(yǎng)。它是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培

4、養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。 原代培養(yǎng)的概念包含以下幾方面含義： 原代培養(yǎng)的實質(zhì)就是初次培養(yǎng)，即培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿中就不再分割，任其生長繁殖而不更換培養(yǎng)物的生長器皿； 原代培養(yǎng)中的“代”并不是指細(xì)胞的“代”數(shù)，原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞在接種之后并不一定沒有分裂增殖。相反，在原代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物中的細(xì)胞也可能經(jīng)歷多次的細(xì)胞分裂活動而產(chǎn)生多個子代細(xì)胞；,2020/7/8,8,原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿，像蓋玻片培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法，即便在換液過程中更換培養(yǎng)器皿，但不更換培養(yǎng)組織細(xì)胞所附著的生長基質(zhì)蓋片，仍屬于原代培養(yǎng)； 植塊培養(yǎng)不一定都是原代培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)有時候在培養(yǎng)

5、物增長到一定程度后，也需要分割培養(yǎng)物為較小的部分再培養(yǎng)。,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,9,、取材及培養(yǎng)材料的制備,、分離（散）細(xì)胞的方法,、接種與培養(yǎng)過程,、更換培養(yǎng)液,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,10,（1）準(zhǔn)備工作：,（2）制備基本步驟（技術(shù)路線）：,主要是取材器具、用品的滅菌以及實驗者、實驗動物的清潔與消毒。,、取材及培養(yǎng)材料的制備：,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,11,大塊組織,洗

6、去血污 剔除多余成分,切成約1mm3大小的植塊 植塊培養(yǎng),將所取組織剪碎 蛋白酶溶液消化 機械方法吹打組織塊 不銹鋼網(wǎng)篩過濾 過濾液離心 用培養(yǎng)液懸浮成細(xì)胞懸液 計數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度 培養(yǎng)分離的細(xì)胞,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（2）基本步驟（技術(shù)路線）：,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,12,、取材及培養(yǎng)材料的制備：,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,關(guān)于取材：,（1)取材要準(zhǔn)確：取材是體外培養(yǎng)工作的開端。如果在這最初的實驗過程中沒有取到合格、理想的實驗材料，整個體外培養(yǎng)過程就很難達(dá)到預(yù)期的目的。 (2)關(guān)于取材及制備培養(yǎng)材料的步驟：就動物不同組織的取材而言，

7、取材的步驟大同小異。但在具體操作過程中，還需要根據(jù)具體的實驗情況做一些調(diào)整。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,13,、取材及培養(yǎng)材料的制備,、分離（散）細(xì)胞的方法,、接種與培養(yǎng)過程,、更換培養(yǎng)液,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,14,（1）機械解離細(xì)胞法： 1）吸管吹打法- 2）過篩法- （2）酶學(xué)解離細(xì)胞法： 1）胰蛋白酶離解細(xì)胞法- 2）膠原酶離解細(xì)胞法- （3）螯合劑解離細(xì)胞法： 常用螯合劑：乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na）、 檸檬酸鈉、 枸櫞酸鈉。,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、分離

8、（散）細(xì)胞的方法：,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,15,、取材及培養(yǎng)材料的制備,、分離（散）細(xì)胞的方法,、接種與培養(yǎng)過程,、更換培養(yǎng)液,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,16,、接種與培養(yǎng)過程,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,接種（seeding）也稱種植(plating)或體外移植(explantation),實際上就是將取材并切割好的組織塊（植塊）或者分離好的細(xì)胞懸液加到培養(yǎng)器皿內(nèi)的過程。 如果將準(zhǔn)備好的植塊（包括器官型植塊）接種并進(jìn)行培養(yǎng)，就稱為植塊培養(yǎng)。體外移植的稱謂較多用于植塊培養(yǎng)的情

9、況。 如果將所制備的細(xì)胞懸液用于種植和培養(yǎng)，就稱為分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,17,、接種與培養(yǎng)過程,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞如果屬于貼壁依賴型細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶皿中必須黏附于一定的生長基質(zhì)表面才能生長，這樣的細(xì)胞一般只能在培養(yǎng)瓶皿表面長滿一層，當(dāng)培養(yǎng)物長滿培養(yǎng)器皿的表面時即會因為接觸抑制而停止生長，這種培養(yǎng)方式就稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（single-layer cell culture)。 如果所培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性，在懸浮狀態(tài)下即可以生長和繁殖，這樣的培養(yǎng)方式就稱為懸浮（細(xì)胞）培養(yǎng)（suspension

10、culture）。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,18,、接種與培養(yǎng)過程,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（1）植塊培養(yǎng)： 植塊培養(yǎng)是比較簡單的培養(yǎng)方法，其技術(shù)要點就是將從動物體內(nèi)所取得的組織切割成一定大小的植塊，再將植塊接種到培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)瓶皿送入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 植塊培養(yǎng)的目的主要有兩個，其一是觀察植塊的組織學(xué)生長行為，其二是通過植塊培養(yǎng)，讓構(gòu)成植塊的細(xì)胞從植塊內(nèi)遷移出來并在植塊外分裂增殖，然后將植塊去除，從而得到細(xì)胞培養(yǎng)物。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,19,、接種與培養(yǎng)過程,二、體外培養(yǎng)的

11、基本方法和過程,（2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)： 相對于植塊培養(yǎng)法，分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)的最大優(yōu)點是：解除了植塊內(nèi)細(xì)胞之間的“組織關(guān)系”，從而可以反映出單個細(xì)胞的生物學(xué)特征。 借助分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)法，還可以分離(isolate)或純化某一類型的細(xì)胞，從而實現(xiàn)對單一細(xì)胞類型（monotypic cell culture）進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究。 動物組織的大多數(shù)細(xì)胞類型都屬于貼壁（錨定）依賴型細(xì)胞（anchorage-dependent cell)。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,20,、接種與培養(yǎng)過程,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（3）生長基質(zhì)： 生長基質(zhì)（gro

12、wth substratum）泛指培養(yǎng)物附著的各種介質(zhì)，狹義特指在塑料或玻璃培養(yǎng)器皿表面上涂布（包被）的一層能夠促進(jìn)培養(yǎng)物黏附、貼壁與鋪展的生物活性物質(zhì)。 一般來說，國際上一些著名廠商生產(chǎn)的塑料或玻璃培養(yǎng)器皿，其使用的材質(zhì)能夠適宜大多數(shù)種類的動物細(xì)胞體外生長。只有少數(shù)黏附和貼壁能力較差的細(xì)胞，需給予提供包被有特殊生長基質(zhì)物質(zhì)的生長表面。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,21,、接種與培養(yǎng)過程,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（4）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)（suspension cell culture） 對于有些細(xì)胞來說，其生長不需要黏附在某一固相表面便能分裂增殖。例如，

13、某些白血病細(xì)胞、某些腹水瘤細(xì)胞等。 體外培養(yǎng)這種細(xì)胞時，可以通過對培養(yǎng)液以及其中的細(xì)胞進(jìn)行不斷攪拌，或?qū)ε囵B(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。也有一些細(xì)胞無須攪拌或用搖床搖動，只要在培養(yǎng)器皿表面涂布一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。這種培養(yǎng)方法就稱為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,22,、取材及培養(yǎng)材料的制備,、分離（散）細(xì)胞的方法,、接種與培養(yǎng)過程,、更換培養(yǎng)液,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,23,、更換培養(yǎng)液,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,隨著培養(yǎng)的進(jìn)程

14、，營養(yǎng)物被消耗，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物愈來愈多，尤其是細(xì)胞呼吸反應(yīng)，釋放出的CO2及其它酸性代謝產(chǎn)物（如乳酸和丙酮酸）越來越多，培養(yǎng)液的pH值越來越低，培養(yǎng)液的顏色越來越黃。 根據(jù)培養(yǎng)液的顏色變化確定換液的間隔時間是很有實際意義的。營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢還取決于所接種的細(xì)胞數(shù)量。 隨著培養(yǎng)過程的繼續(xù)，細(xì)胞會分裂增生，數(shù)量增加，換液的時間間隔就可能越來越短。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,24,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項,（1）關(guān)于培養(yǎng)液： 1)培養(yǎng)基的選擇：培養(yǎng)某一種細(xì)胞，到底選用哪一種培養(yǎng)基，需要根據(jù)細(xì)胞的生長情況摸索確定。 2）添

15、加物：選擇好培養(yǎng)基類型以后，還要摸索需要補加的成分及其添加量。 3)培養(yǎng)液的酸堿度：普通動物細(xì)胞一般適宜的pH范圍為7.27.4當(dāng)pH值低于6.8時，會對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。 4)換液：換液時，如果細(xì)胞密度很低或者細(xì)胞的生長較為緩慢，可以不完全更換培養(yǎng)液，只吸出一半的舊培養(yǎng)液，補加相同體積的新培養(yǎng)液即可。培養(yǎng)液最好經(jīng)事先預(yù)溫至370C。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,25,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項,（2）關(guān)于培養(yǎng)空間： 培養(yǎng)空間是指培養(yǎng)物生存的空間，包括液相環(huán)境與氣相環(huán)境兩方面。 調(diào)整培養(yǎng)空間的主要目的是改變對培養(yǎng)物

16、的供氧量。 一般來說，培養(yǎng)液與液面上的空間二者之間的體積比例以1：10為宜。加入的培養(yǎng)液液面高度最好維持在25mm的范圍。,（一）原代培養(yǎng)（primary culture）,2020/7/8,26,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,5、原代細(xì)胞培養(yǎng)方法的注意事項,（3）其它方面： 必須根據(jù)不同細(xì)胞生命力的不同以及對環(huán)境轉(zhuǎn)變適應(yīng)能力的不同，選擇適宜的取材、分散、種植方法和選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。 除了所培養(yǎng)細(xì)胞自身的活力外，原代培養(yǎng)不成功最大的可能性有兩點：其一是在對組織分散并分離細(xì)胞的過程中嚴(yán)重?fù)p傷了細(xì)胞，其二是給細(xì)胞提供的體外生長環(huán)境，尤其是生長基質(zhì)與培養(yǎng)液條件不合適。,（一）原代培養(yǎng)（primar

17、y culture）,2020/7/8,27,（二）繼代培養(yǎng),（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇,（五）培養(yǎng)物的污染,（一）原代培養(yǎng),二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2020/7/8,28,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。 傳代培養(yǎng)的實質(zhì)就是分割后再次培養(yǎng)。 只要是將培養(yǎng)物從一個培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)移到另一個器皿之內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)就算傳代。即便是按“一傳一”的比例進(jìn)行傳代。,2020/7/8,29,1、原

18、代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo) 2、傳代的過程 3、傳代培養(yǎng)的注意事項,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,30,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（1）植塊培養(yǎng)物與器官培養(yǎng)物： 植塊培養(yǎng)物生長一定時間之后，從植塊內(nèi)長出（outgrowing）的細(xì)胞會越來越多，遷移出來的細(xì)胞也會不斷分裂繁殖，逐漸長滿所附著的生長基質(zhì)表面，細(xì)胞之間逐漸發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象。 若不將原代培養(yǎng)物分割再進(jìn)行培養(yǎng)，植塊培養(yǎng)物可能會停止生長。,1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo),（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,31,二、體外培養(yǎng)的基本方

19、法和過程,（2）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物： 對于貼壁依賴型細(xì)胞來講，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞分裂增殖，數(shù)量愈來愈大，逐漸會在培養(yǎng)瓶皿的底壁形成一完整的細(xì)胞層，細(xì)胞之間因接觸性抑制作用而停止生長，此時便需要進(jìn)行傳代。 判斷分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物是否需要傳代的主要指標(biāo)就是觀察培養(yǎng)物是否已基本長滿培養(yǎng)瓶皿的底壁。,1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo),（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,32,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（3）懸浮培養(yǎng)物： 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞之間雖然不容易發(fā)生接觸性抑制現(xiàn)象，但隨著培養(yǎng)液中細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞的生存空間會越來越小，營養(yǎng)供應(yīng)愈趨緊張，代謝產(chǎn)物積聚，培養(yǎng)

20、環(huán)境逐漸不適應(yīng)細(xì)胞的生長，因而需要傳代。,1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo),（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,33,1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo) 2、傳代的過程 3、傳代培養(yǎng)的注意事項,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,34,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2、傳代的過程,（1）分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)物 ： （貼壁依賴型細(xì)胞）,1）棄去原培養(yǎng)液（吸出或傾倒） ； 2）漂洗：12次， 3）離解細(xì)胞： 4）終止消化： 5）吹打分離細(xì)胞： 6）離心： 7）重新懸浮、計數(shù)： 8）分裝： 9）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)

21、。,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,35,（2）懸浮培養(yǎng)物：無需分割培養(yǎng)物。,1）離心： 2）重新懸浮、計數(shù)： 3）分裝： 4）送培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2、傳代的過程,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,36,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2、傳代的過程,（3）植塊培養(yǎng)物：,對這種培養(yǎng)物，僅在少數(shù)情況下再培養(yǎng)。 由于它們一般是種植在生長基質(zhì)蓋玻片上，再培養(yǎng)時一般不更換生長基質(zhì)蓋玻片，只是將培養(yǎng)物分割并舍棄部分培養(yǎng)物，而將剩余的培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng),（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）

22、,2020/7/8,37,1、原代培養(yǎng)物需要傳代的指標(biāo) 2、傳代的過程 3、傳代培養(yǎng)的注意事項,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,38,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,3、傳代培養(yǎng)的注意事項,傳代培養(yǎng)首先必須注意的事項： 根據(jù)不同細(xì)胞的承受能力； 選擇合適的時間； 采用適當(dāng)?shù)姆椒ā?（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,39,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,3、傳代培養(yǎng)的注意事項,（1）傳代的時機與再培養(yǎng)的細(xì)胞密度： 不要急于傳代是對大多數(shù)生命力較為脆弱的細(xì)胞體外培養(yǎng)的上策。 除非需要利用傳代實現(xiàn)

23、其它的目的，如通過傳代對培養(yǎng)物中的混合細(xì)胞進(jìn)行分離。 由于在體時細(xì)胞之間的相互作用有利于細(xì)胞的生存和生命活動，因而在進(jìn)行體外分離細(xì)胞培養(yǎng)時盡量給細(xì)胞提供相互作用的條件。一個重要的方法就是增大接種的細(xì)胞密度，使培養(yǎng)的細(xì)胞盡快發(fā)生相互作用。,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,40,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,3、傳代培養(yǎng)的注意事項,（2）傳代數(shù)或代數(shù)與培養(yǎng)物的生長： 傳代數(shù)或代數(shù)（passage number）是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)。用它可以相對地衡量某一培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡（culture age）。 經(jīng)過一次傳代，細(xì)胞的生長環(huán)境就發(fā)生一次大的變化。體外生長的

24、細(xì)胞若處于“動蕩”的生活環(huán)境中，其生物學(xué)性狀往往容易發(fā)生改變，尤其是細(xì)胞的遺傳特性可能會發(fā)生改變。 應(yīng)該認(rèn)識到，傳代對細(xì)胞生長和性狀是有影響的，在必要性不強的情況下，少傳代為上。,（二）繼代培養(yǎng)（secondary culture）,2020/7/8,41,（二）繼代培養(yǎng),（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇,（五）培養(yǎng)物的污染,（一）原代培養(yǎng),二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2020/7/8,42,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),這里要介紹的是，體外培養(yǎng)這門技術(shù)從創(chuàng)立以來所發(fā)展起來的、若干種被普遍運用的、具有代表性的基本方法和技術(shù)。 這些基本的

25、方法和技術(shù)有的還在使用，有的則已不常使用，代之以一些改良的方法和技術(shù)。,2020/7/8,43,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),1、懸滴培養(yǎng)法 2、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 3、蓋玻片培養(yǎng)法 4、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 5、灌注小室培養(yǎng)法 6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法 7、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法 8、克隆培養(yǎng)法 9、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 10、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法 11、微囊培養(yǎng)技術(shù),2020/7/8,44,2、培養(yǎng)瓶（culture flask）培養(yǎng)法,凡是可以用于培養(yǎng)生物結(jié)構(gòu)成分的瓶子都可以叫做培養(yǎng)瓶。 早期的培養(yǎng)瓶主要是玻璃培養(yǎng)瓶，如今國外主要用一次性使用的塑料培養(yǎng)瓶。,卡氏瓶（carlsbergs

26、flask） 北京瓶 塑料培養(yǎng)瓶,所謂培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法，就是將擬培養(yǎng)對象直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)的方法。這種培養(yǎng)法只是強調(diào)所用的培養(yǎng)器皿是培養(yǎng)瓶而已。,2020/7/8,45,卡氏瓶,北京瓶,經(jīng)典的培養(yǎng)瓶,2020/7/8,46,6、培養(yǎng)板培養(yǎng)法,培養(yǎng)板培養(yǎng)法過去曾被稱為微量培養(yǎng)法（microculture）： 是現(xiàn)代體外培養(yǎng)技術(shù)中最為普遍應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)方法之一。它是將所培養(yǎng)的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)的一種培養(yǎng)方法。,培養(yǎng)板的應(yīng)用使得細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，使得細(xì)胞培養(yǎng)可以微量培養(yǎng)的方式進(jìn)行，使得科研工作者能夠?qū)ε囵B(yǎng)物進(jìn)行規(guī)范的、定量的組間比較。 培

27、養(yǎng)板一般都是一次性使用的培養(yǎng)器皿，有極為規(guī)范的商品供應(yīng)。,2020/7/8,47,8、克隆培養(yǎng)法（cloning culture technique）,克?。╟lone）一詞既有名詞意義又有動詞含義。 作名詞講時，意指由同一個祖細(xì)胞分裂增生而來的一個子細(xì)胞群，體外培養(yǎng)技術(shù)中常用的細(xì)胞克?。╟ell clone或colony）即為此意。 作動詞解時，克隆一詞主要指從同一個祖細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而產(chǎn)生一個子細(xì)胞群的過程，體外培養(yǎng)技術(shù)中的細(xì)胞克?。╟ell cloning）就是這個意思。,克隆培養(yǎng)法也可以稱作單細(xì)胞分離培養(yǎng)法（single cell culture），就是將從細(xì)胞懸液中獲得的單個細(xì)胞用于培

28、養(yǎng)，使之分裂增殖而產(chǎn)生一個細(xì)胞群的培養(yǎng)方法。,2020/7/8,48,克隆培養(yǎng)法最基本的要求是擬用于培養(yǎng)并分裂增殖的祖細(xì)胞必須是一個細(xì)胞，如此才能獲得具有同一祖先的子細(xì)胞群。,理論上講，各種生物體細(xì)胞都可以進(jìn)行克隆培養(yǎng)，但由于細(xì)胞在體外培養(yǎng)時生長繁殖的環(huán)境、生命力等方面均不如在體時的情況。所以，能夠進(jìn)行克隆培養(yǎng)的細(xì)胞一般只是一些細(xì)胞活力強、增殖能力強、對體外生長環(huán)境適應(yīng)性強的細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化（無限）細(xì)胞系、（胚胎）干細(xì)胞以及微生物細(xì)胞等。這些細(xì)胞種類即便是單個細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)環(huán)境，也可以逐漸適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境并行分裂增殖，從而形成一群子細(xì)胞。,8、克隆培養(yǎng)法（cloning culture

29、technique）,2020/7/8,49,實驗課時間：從第14周開始 實驗課地點：104館三樓東邊,注意事項： 1.網(wǎng)上沒有名字的 同學(xué)請不要填報實 驗課名單。 2.現(xiàn)在不能確定 自己時間的同學(xué) 不要填報，可以 下次上課時再報。 3.一旦填報就不能 再更改時間。,2020/7/8,50,（二）繼代培養(yǎng),（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇,（五）培養(yǎng)物的污染,（一）原代培養(yǎng),二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2020/7/8,51,（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,在體外培養(yǎng)工作中，為了保種和長期保存培養(yǎng)物的活性，常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，并在需要的時

30、候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,冷凍保存（cryopreservation）：就是將體外培養(yǎng)物懸 浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的 冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-70 的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的 過程。 復(fù)蘇（thawing）：就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物 恢復(fù)到常溫的過程。,2020/7/8,52,細(xì)胞內(nèi)的冰晶損傷（intracellular ice-damage）： 是指因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷。,純水 （細(xì)胞懸浮其中）,低于零度,結(jié)冰,細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰,冰晶造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇

31、原理,2020/7/8,53,溶質(zhì)損傷（solute damage）或稱溶液損傷（solution damage） 是指因保存細(xì)胞的溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷。,溶液 （細(xì)胞懸浮其中）,溫度下降,細(xì)胞外的水分先結(jié)冰,在復(fù)溫時，大量水分就會滲入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡,未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高,細(xì)胞在高溶質(zhì)的溶液中時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細(xì)胞便會發(fā)生滲漏。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,2020/7/8,54,在溶液中加入冷凍保護(hù)劑(cryoprotectant)時，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。 因為冷凍保護(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩

32、爾濃度，降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。 在復(fù)蘇時，一般以很快的速度升溫，12 min內(nèi)恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度溶質(zhì)的溶液中過長時間，從而不會產(chǎn)生冰晶損傷和溶質(zhì)損傷，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。 冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,2020/7/8,55,（）冷凍速率,細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生如下生理變化： * 當(dāng)細(xì)胞被冷至-5左右時，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低了溶液的冰點，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰； * 當(dāng)細(xì)胞被冷至-5-15之間時

33、，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能，其結(jié)果是：細(xì)胞內(nèi)水分為了和細(xì)胞外水分保持化學(xué)能的平衡，會向細(xì)胞外流動。,是指降溫的速度。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,2020/7/8,56,冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向細(xì)胞外流動的情況就會不同： （1）冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不發(fā)生結(jié)冰； （2）冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰； （3）冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯瑒t細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀凝固（玻璃化冷凍）。,

34、、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,（）冷凍速率,2020/7/8,57,超快速玻璃化冷凍：是細(xì)胞存活最理想的冷凍方法。 因為細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不造成破壞；細(xì)胞也不會在高濃度溶質(zhì)的溶液中暴露時間過長而受損。,不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。所以，在對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高冷凍存活率。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,（）冷凍速率,2020/7/8,58,（）冷凍保存溫度,是指能長久保存細(xì)胞的超低溫度。,在超低溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，經(jīng)過長期保存在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。,液氮溫度（-196）是

35、目前最佳冷凍保存溫度。 在-196時，細(xì)胞生命活動幾乎停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能保持完好。,如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-196均可保存十年以上。應(yīng)用-70-80條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯下降。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,2020/7/8,59,（）復(fù)溫速率,是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。,復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低凍存細(xì)胞存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好。 復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)會重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。 最佳的復(fù)溫速率與最佳的冷凍速率對保證獲得最佳的凍存效果同等重要。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,2020/7/8,60,（

36、）冷凍保護(hù)劑,是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。,冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類 ： 滲透性冷凍保護(hù)劑：可以滲透到細(xì)胞內(nèi)， 一般是一些小分子的物質(zhì)。 主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酞胺、 甲醇等。 非滲透性冷凍保護(hù)劑：不能滲透到細(xì)胞內(nèi)， 一般是些大分子物質(zhì)。 主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、蔗糖、 聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及 羥乙基淀粉等。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,2020/7/8,61,滲透性冷凍保護(hù)劑保護(hù)細(xì)胞的機制是： （1）在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)

37、的損傷； （2）細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。,甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷，讓甘油或DMSO等充分滲到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到平衡以起到充分的保護(hù)作用。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,（）冷凍保護(hù)劑,2020/7/8,62,非滲透性冷凍保護(hù)劑的保護(hù)機制：(假設(shè)有多種) 其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,（）冷凍保護(hù)劑,2020/7/8,

38、63,不同的冷凍保護(hù)劑有不同的優(yōu)、缺點。目前，有一種趨勢，就是聯(lián)合使用二種以上冷凍保護(hù)劑組成保護(hù)液。 由于許多冷凍保護(hù)劑（如nMSO）在低溫條件下能保護(hù)細(xì)胞，但在常溫下卻對細(xì)胞有害，故在細(xì)胞復(fù)溫融解后要及時洗除冷凍保護(hù)劑。,、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理,（）冷凍保護(hù)劑,2020/7/8,64,、冷凍保存的方法,按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化凍存和玻璃化凍存兩種。,非玻璃化凍存：利角各種溫級的冰箱分階段降溫至 -70 -80 ，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-100以下，再直接投入液氮進(jìn)行

39、保存的方法。 以此種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少有冰晶形成。,玻璃化冷凍：則是指利用多種高濃度冷凍保護(hù)劑組合成的玻璃化冷凍保護(hù)液懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行保存的方法。 以此種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液無冰晶形成。,2020/7/8,65,、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇,（略）,（）非玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法 （）玻璃化凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法,（略）,2020/7/8,66,（二）繼代培養(yǎng),（三）體外培養(yǎng)的基本方法和技術(shù),（四）培養(yǎng)物的凍存與復(fù)蘇,（五）培養(yǎng)物的污染,（一）原代培養(yǎng),二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,2020/7/8,67,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,與培養(yǎng)無關(guān)的雜質(zhì)混入培養(yǎng)系統(tǒng)稱為污染（

40、contamination）。 廣義的污染包括各類微生物的污染、各種培養(yǎng)物間的交叉污染和化學(xué)物質(zhì)的污染。后兩種污染比較容易預(yù)防，而微生物污染的預(yù)防及處理就比較困難，它能直接影響后續(xù)研究工作。 通常論及的培養(yǎng)物污染多指各類微生物（包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）對培養(yǎng)細(xì)胞的污染。,2020/7/8,68,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,判斷所培養(yǎng)細(xì)胞是否被微生物污染，可以通過以下方法進(jìn)行確定： 目測 顯微鏡觀察 電鏡檢查 特殊染色鑒定 微生物培養(yǎng)試驗 免疫學(xué) 分子生物學(xué) 等,其中，免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法因其快速、敏感和特異性強等優(yōu)點已得到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。,、微生物污染的判斷：

41、,2020/7/8,69,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,（）細(xì)菌（bacterial）的污染及其判斷,在細(xì)菌污染培養(yǎng)細(xì)胞的初期，由于受培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的抗生素的作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，這種情況用倒置相差顯微鏡觀察也不易判斷。,*將10 ml左右的細(xì)胞懸液以1000 r/min離心5 min，再用無菌的PBS洗滌2次，加入無抗生素的培養(yǎng)液2 ml后，將細(xì)胞置于370C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。如果培養(yǎng)物真的受到細(xì)菌的污染，就可以在24 h內(nèi)因細(xì)菌的大量繁殖而獲得陽性結(jié)果。,2020/7/8,70,2020/7/8,71,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外

42、培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,*當(dāng)污染的菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時，大約每20 min一代的細(xì)菌增殖速度，會使培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅會消耗培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)大量的養(yǎng)分，也能釋放出大量的代謝產(chǎn)物。幾小時之后，增殖的細(xì)菌即可導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀混濁。酸性代謝產(chǎn)物的累積可使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黃綠色。,（）細(xì)菌（bacterial）的污染及其判斷,2020/7/8,72,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,（）真菌（eumycete）的污染及其判斷,單細(xì)胞真菌稱為酵母菌（yeast fungus）；多細(xì)胞真菌能長出菌絲及孢子并交織成團(tuán)，稱絲狀菌（hyp

43、homycete），又稱霉菌（mycetes）。,污染了酵母菌的培養(yǎng)物，類似細(xì)菌污染。在倒置相差顯微鏡下可以觀察到圓形或卵圓形的酵母菌，開啟培養(yǎng)器皿，可聞到像酒或酸的發(fā)酵樣異味。隨著培養(yǎng)液酸度下降，培養(yǎng)液外觀呈現(xiàn)黃綠色。,2020/7/8,73,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,（）真菌的污染及其判斷,污染了霉菌的培養(yǎng)物，在倒置相差顯微鏡下能觀察到呈絲狀或樹枝狀生長的菌絲。這些菌絲在培養(yǎng)液中可以長成白色的絲狀團(tuán)塊，如棉絮狀漂浮在培養(yǎng)液中，有的附著在培養(yǎng)器皿或培養(yǎng)物的表面。,2020/7/8,74,2020/7/8,75,2020/7/8,76,（五）培養(yǎng)物

44、的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,（）支原體（mycoplasma）的污染及其判斷,受支原體污染的培養(yǎng)細(xì)胞在顯微鏡下無特殊的外觀表現(xiàn)，培養(yǎng)液也不渾濁。 由于對支原體污染難以觀察到特殊的外觀變化，要在污染的早期發(fā)現(xiàn)和處理是相當(dāng)困難的。,2020/7/8,77,(細(xì)胞碎片),（支原體）,2020/7/8,78,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細(xì)胞較多，培養(yǎng)細(xì)胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時，應(yīng)懷疑培養(yǎng)物可能受支原體污染。 必要時應(yīng)借助有關(guān)檢測技術(shù)對培養(yǎng)物進(jìn)行特殊檢測，如DNA熒光

45、染色法、聚合酶鏈反應(yīng)方法、免疫學(xué)方法以及支原體培養(yǎng)法。,（）支原體（mycoplasma）的污染及其判斷,2020/7/8,79,（五）培養(yǎng)物的污染,二、體外培養(yǎng)的基本方法和過程,、微生物污染的判斷：,（）病毒（virus）的污染及其判斷,細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒污染來源可以是原宿主體細(xì)胞的潛伏性感染，也可以是細(xì)胞膜受體或其它理化方法誘導(dǎo)后進(jìn)入的。,判斷培養(yǎng)的細(xì)胞是否被病毒污染，其困難之處在于病毒種類的復(fù)雜性和相應(yīng)的宿主細(xì)胞的特異性。,2020/7/8,80,感染了病毒的宿主細(xì)胞形態(tài)學(xué)上不一定有顯著的特異性的改變，因此僅依據(jù)用目測或顯微鏡觀察到的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化來判斷是否受病毒的污染是不充分的。 應(yīng)根據(jù)不同的病毒選用不同