1、1,生化與分子生物學(xué)研究思路與技術(shù),中南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 生物化學(xué)系,生物化學(xué)研究所 陳漢春E-mail: ,2,生物化學(xué) :,研究活細(xì)胞及有機(jī)體內(nèi)各種分子及其相互間化學(xué)反應(yīng)的科學(xué)。 研究活細(xì)胞的化學(xué)組成及相互反應(yīng)和進(jìn)程的科學(xué)，即“生命的化學(xué)” 。 生命科學(xué)的基礎(chǔ)語言，即研究生命的分子基礎(chǔ)(molecular basis of life)。,3,一.生物化學(xué)研究的目的：,從分子水平了解活細(xì)胞相關(guān)的所有化學(xué)進(jìn)程。 對(duì)健康、營(yíng)養(yǎng)的理解和維持以及對(duì)疾病的發(fā)生機(jī)理的闡明和有效治療。,4,二.生物化學(xué)的研究對(duì)象：,研究生物分子的組成成分如碳、氫、氧、氮、磷等化學(xué)元素

2、以及水和無機(jī)鹽代謝。 研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多糖及脂類的結(jié)構(gòu)、功能、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及這些生物大分子的代謝和相互作用。,5,三.生物化學(xué)研究的發(fā)展：,生物化學(xué)研究歷經(jīng)兩百多年進(jìn)入分子生物學(xué)年代，走過了三個(gè)發(fā)展階段： 敘述生物化學(xué)階段 動(dòng)態(tài)生物化學(xué)階段 功能或分子生物化學(xué)階段,6,敘述生物化學(xué)(descriptive biochemistry)階段(17701903),又稱為靜態(tài)或形態(tài)生物化學(xué)(static or morphological biochemistry)。該時(shí)期多依附于有機(jī)化學(xué)，開始詳盡研究生物體內(nèi)主要化學(xué)物質(zhì)的組成，分離出各種氨基酸、脂酸、甘油、糖類、檸檬酸、

3、乳酸和蘋果酸。從肝中分離糖元，發(fā)現(xiàn)了核質(zhì)（nuclein）及核酸。奠定了酶學(xué)基礎(chǔ)理論?；旧辖鉀Q了酶的催化特性、作用機(jī)理和影響因素等問題。,7,我國(guó)人民在公元前二十一世紀(jì)，已用曲釀酒，稱曲為酒母，又叫做酶；公元前十二世紀(jì)，已將豆、谷發(fā)酵，搗爛、加鹽以造醬，并制出麥芽糖，當(dāng)時(shí)稱為 “飴”。公元九世紀(jì)或十世紀(jì)已制成豆?jié){和豆腐。,此階段中國(guó)人民的貢獻(xiàn)：,8,2. 動(dòng)態(tài)生物化學(xué)(dynamic biochemistry)階段（19031950）,又稱為生理化學(xué)（physiological chemistry）。該時(shí)期主要研究生物體內(nèi)組成物質(zhì)的化學(xué)變化及相互轉(zhuǎn)變。分離制備結(jié)晶酶，闡明細(xì)胞氧化和呼吸鏈及維

4、生素和激素化學(xué)性質(zhì)與生理作用。建立了有關(guān)發(fā)酵和三羧酸循環(huán)、脂酸的氧化作用以及肝中尿素合成的完整生化途徑，能初步動(dòng)態(tài)地解釋許多生命現(xiàn)象的本質(zhì)，如生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、呼吸、造血和消化等，使生物化學(xué)進(jìn)入了一個(gè)興旺的發(fā)展時(shí)期。,9,此階段中國(guó)人民的貢獻(xiàn)：,該時(shí)期，我國(guó)生物化學(xué)家建立了血濾液制備與血糖測(cè)定的生化方法，迄今還為實(shí)驗(yàn)室采用。在蛋白質(zhì)研究中，提出了蛋白質(zhì)變性學(xué)說，并一直獲得世界同行公認(rèn)。在免疫學(xué)方面，首先使用定量分析技術(shù)研究抗原抗體反應(yīng)的機(jī)理。,10,3. 功能或分子生物化學(xué)（functional or molecular biochemistry）階段 （1950年至今）,該時(shí)期主要從分子水平

5、探索蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)和它們的相互作用，包括蛋白質(zhì)和核酸的提純，其化學(xué)組成、氨基酸或核苷酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列以及空間構(gòu)型、構(gòu)象的確定，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立，生命物質(zhì)如肽激素、tRNA和核酶的人工合成，分子克隆技術(shù)的建立，代謝調(diào)控和生物膜研究的開展，均有助于揭開生命起源和實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的基因治療。分子遺傳學(xué)和遺傳工程技術(shù)的建立，為培養(yǎng)動(dòng)植物的新品種，促進(jìn)工農(nóng)業(yè)的變革，提供了新思路。,11,此階段中國(guó)人民的貢獻(xiàn)：,該時(shí)期，我國(guó)生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性的牛胰島素，1972年借助X-射線衍射技術(shù)研究了豬胰島素分子的晶體結(jié)構(gòu)，1981年首次合成具生物活性的酵

6、母丙氨酸t(yī)RNA。九十年代，成功制備重組因子和促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin），參與完成人類基因組計(jì)劃。,12,四.生化研究的基本思路 和技術(shù)路線：,經(jīng)典的生物化學(xué)研究包括三個(gè)主要步驟： 分離細(xì)胞器和生物分子。 判斷生物分子的結(jié)構(gòu)。 分析生物分子的功能和代謝（合成與 分解）及其相互作用。,13,1 .細(xì)胞器和生物分子的分離：,細(xì)胞器是一種獨(dú)立亞細(xì)胞單位，具有膜結(jié)構(gòu)。按照這個(gè)定義，核糖體、細(xì)胞骨架還有細(xì)胞質(zhì)都不屬于細(xì)胞器。然而，我們可以把它們看作一種亞細(xì)胞功能實(shí)體。一般采用勻漿及離心等操作過程進(jìn)行亞細(xì)胞分離。分離后還必須采用測(cè)量“標(biāo)志”酶及特殊化學(xué)成分或電子顯微鏡觀察的方法來評(píng)估各

7、亞細(xì)胞組分。,14,像分析細(xì)胞器一樣，如果要了解生物分子的結(jié)構(gòu)，首先必須得到純化的生物分子。用于分離和純化生物分子的方法層出不窮，例如鹽析法、層析法(紙、離子交換、薄層、氣液相、高壓液相層析)、凝膠過濾、電泳(紙、高壓、瓊脂糖凝膠、醋酸纖維素簿膜、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠、SDS-PAGE)、超速離心等。要得到均一性的生物分子往往需要綜合性采用多種方法。,15,細(xì)胞器的標(biāo)志性成分和主要功能,16,2 .生物分子的結(jié)構(gòu)確定 ：,質(zhì)譜和核磁共振已成為結(jié)構(gòu)分析的常規(guī)方法。某些已知特性的酶已成為分析某些生物分子結(jié)構(gòu)的有用工具。利用高清晰度的核磁共振質(zhì)譜儀可以分析許多蛋白質(zhì)和某些生物分子上復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)，

8、使用X-射線衍射和晶體學(xué)方法可以得出生物分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)(fine structure)。目前用于確定生物分子結(jié)構(gòu)的經(jīng)典方法包括元素分析、紫外光譜、可見光譜、紅外光譜和核磁共振光譜、用酸或堿將待研究的生物分子水解成為其基本成分、利用多種已知特性的酶(如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶)降解待研究的生物分子等。,17,3 .生物分子的功能和代謝分析：,1）生物分子的功能分析 人類和動(dòng)物的研究最初是從動(dòng)物整體水平開始的，例如對(duì)呼吸和消化的研究。很明顯要在動(dòng)物整體水平研究中找到問題的確切答案是復(fù)雜和困難的。因此將許多整體動(dòng)物水平的復(fù)雜現(xiàn)象轉(zhuǎn)移到體外研究則簡(jiǎn)單得多。,18,不同層次研究生物分子功能的方法,19,2

9、）生物分子的代謝分析：,生化代謝途徑是指一系列由酶催化的生物化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)包括由一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)單的分子合成復(fù)雜的復(fù)合物以及一個(gè)復(fù)合物降解為其終產(chǎn)物的過程，復(fù)雜的生化反應(yīng)和特定的代謝途徑的存在是從整體動(dòng)物水平觀察到的。,20,某些氨基酸、糖和脂肪酸可以與一個(gè)合適的穩(wěn)定同位素結(jié)合，然后注入動(dòng)物體內(nèi)或用于體外實(shí)驗(yàn)來觀測(cè)它們的代謝過程（例如半衰期及與其它生物分子的轉(zhuǎn)化）。標(biāo)記有合適的穩(wěn)定同位素的復(fù)合物可以用來觀察蛋白質(zhì)、糖類和脂類的代謝過程。這些研究證實(shí)代謝是一個(gè)很活躍的過程，細(xì)胞內(nèi)大部分復(fù)合物都在不停地合成和降解。,21,五.分析生化反應(yīng)的總體策略 ：,整體動(dòng)物水平觀察和推論某種生化反應(yīng)或代謝途徑

10、的存在 體外研究它的調(diào)控機(jī)制 分析它在特定疾病中的作用 將它定位于一個(gè)或多個(gè)器官 定位于一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞器或亞細(xì)胞組分 確定與之相關(guān)的其它生化反應(yīng) 純化該反應(yīng)的底物、產(chǎn)物、酶和輔因子及其它成分 確定該反應(yīng)的體外控制機(jī)制 分析該反應(yīng)的體內(nèi)調(diào)控機(jī)制 體內(nèi)外重建該反應(yīng) 用重組DNA技術(shù)在基因水平研究該反應(yīng)。,22,六.生化研究技術(shù)的進(jìn)步：,生命科學(xué)研究的主要目的在于獲得最新的基礎(chǔ)信息，例如純化和鑒定新發(fā)現(xiàn)的酶及其功能，生物化學(xué)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要分支，生化研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)飛速發(fā)展，分子生物學(xué)新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，為生命科學(xué)研究工作者提供了有用的工具。,23,1.細(xì)胞器及生物分子的分離與純化：,活細(xì)胞

11、中簡(jiǎn)單的生物分子是大分子的結(jié)構(gòu)單位，大分子是超分子復(fù)合物的成分，超分子復(fù)合物裝配成細(xì)胞器，細(xì)胞器則和其它結(jié)構(gòu)一起組成細(xì)胞。因此，細(xì)胞的功能實(shí)際上是細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其生物分子功能的綜合體現(xiàn)。為了研究細(xì)胞器及生物分子的結(jié)構(gòu)與功能以及其代謝和作用機(jī)制，必須從組織或細(xì)胞中分離出來這些生物分子或亞細(xì)胞復(fù)合物。,24,基本技術(shù)：,勻漿 離心 層析 電泳,25,1）勻漿:,破壞細(xì)胞或組織的固有結(jié)構(gòu)，使 細(xì)胞破裂而釋放胞內(nèi)容物 。 方法: 化學(xué)(酶消化)、物理(超聲)或機(jī)械(碾磨)。 要求: 保持生物分子或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。 措施: 合適pH值、合適離子強(qiáng)度、緩沖液、 低溫(0 4 ) 、短時(shí)間、蛋白酶抑

12、 制劑、核酸酶抑制劑。,26,使樣品繞離心機(jī)轉(zhuǎn)軸的中心旋轉(zhuǎn)而獲得一個(gè) 遠(yuǎn)大于地球重力的沉降應(yīng)用力，樣品介質(zhì)中 不同大小、形狀和密度的顆粒將以不同的速 度沉降。 影響因素: 離心力(轉(zhuǎn)速及顆粒與中心軸的 距離)，顆粒的大小、形狀、密 度，介質(zhì)的粘度。,2）離心：,27,低速離心: 6 000 r/min 、室溫， RCF (相對(duì)離心力)6 000 g ； 高速離心: 6 000 25 000 r/min 、低溫， RCF = 6 000 60 000 g ； 超速離心: 25 000 r/min 、低溫 + 真空， RCF = 60 000 600 000 g ； 差速離心: 連續(xù)用幾種遞增的離

13、心速率離心。 密度梯度離心: 樣品中不同組份在離心力場(chǎng)的 作用下停留于相應(yīng)密度的支持物 層面(如Percoll分離血細(xì)胞)。,類型:,28,根據(jù)樣品中各組分物理生化特性、分子大小形狀、所帶電荷、揮發(fā)性、溶解性及吸附性或親和性等的不同而將它們分離。 類型: 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾、疏水相互作用層析、親和層析、共價(jià)層析和金屬螯合層析。,3）層析（色譜分析）：,29,常用層析法:,薄層層析和紙層析； 柱層析； 高效液相層析 ； 氣相色譜。,30,薄層層析和紙層析:,將樣品點(diǎn)在薄層或紙(支持基質(zhì)又稱層析床或固定相 )的一端，展層劑(流動(dòng)相)沿著薄層或紙向上展開并帶動(dòng)樣品中的物質(zhì)遷移

14、。 相對(duì)遷移率: Rf = 組分移動(dòng)距離/溶劑移動(dòng)距離； Rx = 待測(cè)物移動(dòng)距離/標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)距離。,31,柱層析:,將樣品從裝有固定相的柱頂部加入，然后在重力或蠕動(dòng)泵的作用下使流動(dòng)相過柱并帶動(dòng)樣品中的不同組分進(jìn)入固定相，樣品中各組分在固定相中會(huì)形成不連續(xù)帶型，繼而用流動(dòng)相洗脫，用一系列試管分別收集各時(shí)間段流出的洗脫液進(jìn)行定量或定性分析。,32,33,4）電泳：,根據(jù)帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中移動(dòng)的原理而分離、分析復(fù)雜混合物及純化、鑒定離體生物分子。 影響因素: 荷電分子在電泳過程中的遷移率取決于分子所帶的凈電荷量、分子的形狀與大小及電場(chǎng)強(qiáng)度。,34,電泳支持物:,惰性支持物(如醋酸纖維素) : 僅

15、提供物理支持，分離的效果只取決于分子的電荷 密度 。 多孔支持物(如Agarose、PAG) : 同時(shí)利用了分子篩效應(yīng)，分離效果取決于電荷密度 和分子大小及形狀。,35,電泳緩沖系統(tǒng):,連續(xù)緩沖系統(tǒng): 指樣品、凝膠和緩沖液含有相同的緩沖離子， 具有相同的pH值。 非連續(xù)緩沖系統(tǒng): 指凝膠及緩沖液中的緩沖離子和pH值均不同。,36,常用電泳技術(shù):,基本電泳 等電聚焦 毛細(xì)管電泳 雙向電泳,37,基本電泳: 紙電泳、醋纖膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳。,38,39,等電聚焦: 等電聚焦在pH梯度下進(jìn)行。pH梯度由結(jié)構(gòu)類似的小 分子量?jī)尚噪娊赓|(zhì)形成，這些兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn) (pI)在p

16、H 310之間。當(dāng)存在外加電場(chǎng)時(shí)，每一種 兩性電解質(zhì)向其pI值處移動(dòng)而形成穩(wěn)定的pH梯度。 電泳過程中每一種帶電分子如蛋白質(zhì)都朝自己的pI 位置移動(dòng)而被分離。,40,毛細(xì)管電泳:,毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)在于分辨力高和應(yīng)用范圍廣，可以分析極少量的樣品(5 nl10 nl)和各種生物分子如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、藥物、維生素、有機(jī)及無機(jī)離子等。較常應(yīng)用的有毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管凝膠電泳和毛細(xì)管等電聚焦。,41,雙向電泳,雙向電泳是一種分辨力極高的電泳技術(shù)，目前廣泛用于基因 表達(dá)譜及蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 第一向: 根據(jù)蛋白質(zhì)所帶的電荷而進(jìn)行等電聚焦。 第二向: 利用樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量不同，在另一方向上進(jìn)行S

17、DS- PAGE。 雙向電泳可一次性分離1000種蛋白質(zhì)。雙向電泳圖譜的分析 需要由計(jì)算機(jī)輔助的凝膠掃描儀來獲取、儲(chǔ)存和處理從圖譜 中得到的數(shù)據(jù)，既可準(zhǔn)確分析斑點(diǎn)又可進(jìn)行單一蛋白質(zhì)的定 量分析。,42,43,2D gel in proteomics,44,點(diǎn)匹配結(jié)果:,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蛋白點(diǎn)匹配圖,45,2.生物分子的分離與純化：,1）蛋白質(zhì)純化； 2）DNA提取； 3）RNA提??； 4）糖類提??； 5）脂類提取。,46,1）蛋白質(zhì)純化:,目的: 確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān) 系；研究酶的動(dòng)力學(xué)及其調(diào)節(jié)；藥用成份的 分離與鑒定。 方法: 勻漿、離心、電泳、過濾、層析、抽提、透 析等。

18、要求: 合適的緩沖體系、低溫、蛋白酶抑制劑。 濃度和質(zhì)量檢測(cè): 分光光度法、PAGE 。,47,2）DNA提取:,原則 : 保持核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。 去除雜質(zhì)，保證核酸足夠純。 步驟： 破膜 釋放出目的核酸分子。 分離 通過酶、有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH 值、離心等手段得到粗制品。 純化 進(jìn)一步去除雜質(zhì)。 濃度和質(zhì)量檢測(cè): 分光光度法、 Agarose凝膠電泳。,48,基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜 M: DNA/HindIII 分子量標(biāo)準(zhǔn)， 泳道14分別代表4個(gè)不同樣品的基因組DNA,49,3） RNA提取:,哺乳動(dòng)物細(xì)胞總RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA (1

19、0%-15%)、mRNA(1%-5%)組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。 注意事項(xiàng): 使用RNA酶抑制劑； 防止污染。,50,總RNA和mRNA的瓊脂糖凝膠（1）電泳圖譜,51,七. 生物分子的結(jié)構(gòu)與功能分析：,1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 2. 酶活力檢測(cè) 3. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 4. DNA序列分析 5. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）6. 分子雜交 7. 基因克隆 8. 基因組文庫構(gòu)建 9. cDNA文庫構(gòu)建 10. 文庫篩選 11. 報(bào)告基因檢測(cè) 12. 基因芯片 13. 基因敲除 14. RNAi 15. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,52,分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成,測(cè)定多肽鏈的氨基末端與羧基

20、末端的氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析,測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法,一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對(duì)比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。,1. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析:,53,通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質(zhì)的基因,測(cè)定DNA序列,排列出mRNA序列,54,2. 酶活力檢測(cè):,酶是一類加快特定生化反應(yīng)速度的球蛋白。在底物濃度、pH值及溫度等適宜的條件下，每種酶控制著一些結(jié)構(gòu)相似的底物生成產(chǎn)物。 通過酶反應(yīng)速度來測(cè)定酶活性，推薦使用的酶活性單位(SI單位)指在最適條件下，一

21、秒內(nèi)將1 mol底物全部轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。,55,3. 蛋白質(zhì)組學(xué)分析:,一個(gè)細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)。蛋白質(zhì)是基因功能的實(shí)施者，因此對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的基礎(chǔ)。 方法: 二維電泳、質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片等。,56,4. DNA序列分析:,DNA序列分析(DNA sequencing)即測(cè)定DNA鏈中四種核苷酸(堿基)的排列順序。 測(cè)序反應(yīng)使用特異引物與單鏈DNA模板結(jié)合，由DNA聚合酶催化引物延伸，當(dāng)遇到雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)時(shí)即發(fā)生堿基特異性鏈終止，而引物延伸合成的新

22、鏈DNA即是待測(cè)DNA模板的互補(bǔ)鏈。 反應(yīng)中加入一種帶有放射性同位素(如32P或35S)的底物dNTP，這類具有放射活性的dNTP同樣遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則而摻入新合成的模板互補(bǔ)鏈中。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后對(duì)X-光片曝光即可獲得長(zhǎng)度相差一個(gè)核苷酸的DNA鏈分離圖譜。,57,5. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）:,Polymerase chain reaction（ PCR）技術(shù)是利用DNA 聚合酶在體外條件下，催化一對(duì)引物之間特異DNA片段合成的基因擴(kuò)增技術(shù)。 PCR包括三個(gè)基本過程： 變性。在高溫條件下使雙鏈模板DNA解鏈成為單鏈DNA； 退火。在較低溫度時(shí)使加入的引物與單鏈DNA模板特異性結(jié)

23、合； 延伸。在適當(dāng)?shù)臏囟认拢琓aq DNA聚合酶從結(jié)合到DNA模板上的引物3-OH端開始，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，按照DNA模板核苷酸序列，進(jìn)行DNA鏈的延伸，合成與模板互補(bǔ)的新的DNA分子。 這三個(gè)過程組成一個(gè)循環(huán)周期,每個(gè)周期合成的產(chǎn)物又可作為下一個(gè)周期的模板，如此循環(huán)往復(fù)，目的DNA片段的拷貝數(shù)呈指數(shù)形式擴(kuò)增，從而獲得大量的目的DNA片段用于進(jìn)一步分析。,58,在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。

24、 這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。,6. 分子雜交(hybridization),59,DNA-DNA 雜交雙鏈分子,不同來源的DNA分子,60,Southern印跡雜交 :,利用瓊脂糖凝膠電泳將經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化的DNA片段分離，并使這些DNA片段在凝膠原位經(jīng)堿變性處理(解鏈成單鏈)后, 從凝膠轉(zhuǎn)移至一固相支持物(通常是硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上，再與放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記的核酸探針雜交，經(jīng)放射自顯影、酶底物顯色或化學(xué)發(fā)光等方法確定膜上與探針互補(bǔ)的電泳區(qū)帶位置。,61,Northern印

25、跡雜交 :,用于檢測(cè)組織、細(xì)胞中某基因的表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)水平。 基本原理和方法與Southern印跡雜交相似: RNA在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，被轉(zhuǎn)移至尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，然后與標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交。 為了篩選差異表達(dá)基因, Diatchen等建立了抑制性消減雜交技術(shù)。,62,Western免疫印跡:,基本原理與Southern 印跡雜交和Northern印跡雜交十分相似，都是由凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交和信號(hào)顯示等步驟組成。不同之處是Western免疫印跡檢測(cè)的是蛋白質(zhì)，使用的凝膠是SDS聚丙烯酰胺凝膠, 所用的探針是蛋白質(zhì)抗體，而不是核酸。,63,7. 基因克隆:,重組DNA技術(shù)是用

26、酶學(xué)方法將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行剪切和重新連接, 組裝成一個(gè)新的DNA分子。在此基礎(chǔ)上，將這個(gè)DNA分子導(dǎo)入到一定的宿主細(xì)胞，使它能夠在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程即稱為基因克隆(gene cloning)。,64,基因克隆包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)：, 目的基因和載體的獲得； 目的基因與載體連接，形成重組分子； 重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞； 含有重組DNA分子的細(xì)胞的篩選和擴(kuò)增。,65,8. 基因組文庫構(gòu)建:,基因組文庫(genomic DNA library)是含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。 構(gòu)建文庫時(shí)，先提純?nèi)旧wDNA，通過機(jī)械剪切或酶切使之成為一定

27、大小的片段，然后與適當(dāng)?shù)妮d體（如噬菌體）DNA連接，經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)染宿主菌，得到一組含有不同DNA片段的重組噬菌體顆粒，含有目的基因片段的重組子可通過標(biāo)記探針與基因組文庫雜交而篩選出來，用于進(jìn)一步的研究。,66,9. cDNA文庫構(gòu)建:,cDNA是指以mRNA為模板，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化形成的互補(bǔ)DNA（cDNA），其核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板mRNA鏈；再以cDNA為模板，由DNA聚合酶合成第二鏈，得到互補(bǔ)雙鏈DNA。,67,由于模板mRNA含有該種細(xì)胞的各種mRNA分子，因而合成的cDNA產(chǎn)物是各種mRNA拷貝的混合物；然后將雙鏈產(chǎn)物與載體（質(zhì)粒或噬菌體）DNA重組，并轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌或包裝成噬菌體

28、顆粒，得到一系列重組的克隆混合體。每個(gè)克隆含單獨(dú)一種mRNA分子，克隆總和則包含細(xì)胞的全部mRNA信息，此即為cDNA文庫(cDNA library)。,cDNA文庫(cDNA library):,68,10. 文庫篩選:,文庫篩選方法有多種,如核酸分子雜交、利用抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)方法等。 通過文庫篩選，可以獲得基因全長(zhǎng)、分離出對(duì)應(yīng)稀有mRNA的cDNA片段及鑒定目的重組子等。,69,11. 報(bào)告基因檢測(cè):,報(bào)告基因(reporter gene)是指那些表達(dá)產(chǎn)物容易被檢測(cè)的基因。含報(bào)告基因的載體是研究順式作用元件的重要工具。為了檢測(cè)順式作用元件的部位及功能，利用基因重組技術(shù)，將待檢測(cè)的DNA

29、片段插入報(bào)告基因表達(dá)載體中報(bào)告基因的上游，然后轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞并表達(dá)，通過測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物，即可推測(cè)出該DNA片段在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。,70,12. 基因芯片:,基因芯片(gene chip)是九十年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)，它融合了生命科學(xué)、化學(xué)、微電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)等多學(xué)科的最新技術(shù)。,71,DNA芯片（基因芯片）,將大量的已知的DNA片段為探針，有序地、高密度地排列在玻離、硅等載體上。 將待測(cè)樣品用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，并與DNA芯片進(jìn)行分子雜交后進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。通過對(duì)芯片掃描獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。,72,芯片設(shè)計(jì),73,目 錄,74,13. 基因敲除:

30、,基因敲除（gene knock out），類似早期生理學(xué)研究的三部曲: 切除部分觀察整體推測(cè)功能。 gene knock out是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它序列相近基因取代，然后從整體及分子水平觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。,75,基因敲除的技術(shù)路線：,（1）構(gòu)建重組基因載體。（2）用電穿孔、顯微注射等方法將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)。（3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞。（4）將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。基因敲除的靶細(xì)胞目前最常用的是小鼠ES細(xì)胞。,76,siRNA (small

31、interfering RNAs： 2123核苷酸長(zhǎng)的 dsRNA小片段 ),14. RNA interference 雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻抑作用被稱為RNA干預(yù)（RNA interference, RNAi），是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。,77,安德魯法爾(Andrew Fire， 1959年)， 美國(guó)斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授,克雷格梅洛(Craig C. Mello, 1960年)，美國(guó)馬薩諸塞州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授。,78,RNA干擾過程圖,79,RNAi研究被Science雜志評(píng)為2001年的十大科學(xué)成就之一； RNAi研究被列為2002年Science雜志評(píng)的十大科學(xué)成

32、就之首； RNAi研究被授予2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)； Dr. Fire and Mello分享了1000萬瑞典克朗（約合140萬美元）的獎(jiǎng)金。 “沉默” 是金。,80,15. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）技術(shù)是通過遺傳工程的手段對(duì)動(dòng)物基因組的結(jié)構(gòu)或組成進(jìn)行人為的修飾或改造，并通過相應(yīng)的動(dòng)物育種技術(shù)使得這些經(jīng)修飾改造后的基因組在世代間得以傳遞和表現(xiàn)。,81,八. 生物大分子相互作用分析:,生化反應(yīng)過程實(shí)際上是生物分子間的相互作用過程。生物大分子間的相互作用是它們的功能基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，建立了一系列研究核酸及蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。,82,生物大分子相互作用分析技術(shù):,凝膠阻滯分析法 DNA酶足紋分析法 蛋白質(zhì)芯片 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì),83,1. 凝膠阻滯分析法:,凝膠阻滯分析法(gel retardation assay)又稱遷移率改變法(mobility shift assay)或凝膠電泳DNA結(jié)合分析法,是一種簡(jiǎn)單快速而又靈敏可靠的用于檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。