1、 小麥葉片中細胞器中重金屬含量測定一 實驗?zāi)康? 了解生物毒性的一般方法。2 掌握勻漿器、原子吸收儀的使用。3 掌握生物樣品的處理方法。二 實驗原理濕法消化：使用具有強氧化性酸混合液（如hno3、hcl、hclo4等），式樣共同加熱消化，使細胞器中的金屬元素鋅、銅、鎘以離子態(tài)溶解在消解液中。差速離心法：細胞內(nèi)不同細胞器的比重和大小都不相同，在均勻密度介質(zhì)中不同離心力下沉降的細胞器組成不同或在梯度介質(zhì)中離心后分布于不同密度層，根據(jù)這一原理，差速離心法或密度梯度離心法就可將細胞內(nèi)各種組分分離出來。分離流程：破碎組織（勻漿或研磨）差速離心或密度梯度離心分離細胞器結(jié)果檢驗分析原子吸收分光光度計一般由四

2、大部分組成，即光源（單色銳線輻射源）、試樣原子化器、單色儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（包括光電轉(zhuǎn)換器及相應(yīng)的檢測裝置）。原子化器主要有兩大類，即火焰原子化器和電熱原子化器?；鹧嬗卸喾N火焰，目前普遍應(yīng)用的是空氣乙炔火焰。電熱原子化器普遍應(yīng)用的是石墨爐原子化器，因而原子吸收分光光度計，就有火焰原子吸收分光光度計和帶石墨爐的原子吸收分光光度計。前者原子化的溫度在21002400之間，后者在29003000之間?；鹧嬖游辗止夤舛扔嫞每諝庖胰矞y定的元素可達30多種，若使用氧化亞氮乙炔火焰，測定的元素可達70多種。但氧化亞氮乙炔火焰安全性較差，應(yīng)用不普遍?？諝庖胰不鹧嬖游辗止夤舛确?，一般可檢測到ppm級（

3、10-6），精密度1%左右。國產(chǎn)的火焰原子吸收分光光度計，都可配備各種型號的氫化物發(fā)生器（屬電加熱原子化器），利用氫化物發(fā)生器，可測定砷（as）、銻（sb）、鍺（ge）、碲（te）等元素。一般靈敏度在ng/ml級（109），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2%左右。汞(hg)可用冷原子吸收法測定。石墨爐原子吸收分光光度計，可以測定近50種元素。石墨爐法，進樣量少，靈敏度高，有的元素也可以分析到pg/ml級。三 實驗內(nèi)容1 實驗液的預(yù)處理。2 小麥葉片中細胞器中的重金屬含量。四 實驗儀器設(shè)備和材料清單1 儀器設(shè)備：25ml勻漿器，電熱板，原子吸收儀，石墨爐原子吸收分光光度計，電子分析天平，離心機； 25ml、50m

4、l比色管，離心管，50ml燒杯，50ml、500ml容量瓶，玻璃珠若干，剪刀，鑷子。1ml、2ml、5ml、10ml、25ml移液管，洗瓶，紗布。2 溶液：勻漿液（組成為: 蔗糖250mmol/l，trie-hcl ph7.5 50mmol/l，二硫赤蘚糖醇1mmol/l），濃硝酸，高氯酸，濃鹽酸，蒸餾水，濃硫酸，硫酸銅，銅。五 實驗步驟1 勻漿：用電子分析天平準(zhǔn)確稱取小麥葉片，稱量完放入勻漿器，加入5ml上述勻漿液，將小麥勻漿，勻漿液放于50ml燒杯中待用。2 細胞器的分離：用高速冷凍離心機在不同轉(zhuǎn)速下分離細胞器。(差速離心法)3 消化：將每次分離的細胞器溶液倒入50ml小燒杯中，放于電加熱

5、板上，加入幾粒玻璃珠后，加入濃硝酸：高氯酸=3:1的溶液，慢慢升溫至160攝氏度，加熱至近干，如仍有顏色，再以1:3的比例加入高氯酸和濃硝酸直至顏色消失得到澄清透明的溶液。每次分離的細胞器都重復(fù)這個步驟。4 定容：將以上消化完全的溶液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用蒸餾水定容。5 銅含量的測定銅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：（1） 銅標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.5000g金屬銅，加入10m硝酸（1:1），低溫加熱溶解并蒸干至近干，再加入5ml硫酸（1:1），小心繼續(xù)蒸發(fā)至冒白煙，冷卻后加水浸取，待鹽類全部溶解，冷卻后移入500ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。此溶液1ml含有1mg銅。（2） 銅混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：取銅標(biāo)準(zhǔn)

6、貯備液2.5ml，用0.2%硝酸稀釋至50ml，得到50mg/l的銅溶液。（3） 銅標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.5、1.5、2.5和5ml，分別放入五個50ml比色管中，用0.2%硝酸稀釋定容。（4） 用火焰原子吸收分光光度法在324.7nm條件下測定以上梯度銅溶液，并繪制銅標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得吸光度和銅濃度的比例關(guān)系。（5） 通過銅標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出小麥中各細胞器中的銅含量。（6） 計算：以bcf值做指標(biāo)：bcf是生物組織（干重）中化合物的濃度和溶解在水中的濃度之比，也可以認為是生物對化合物的吸收速率與生物體內(nèi)化合物凈化速率之比，用來表示有機化合物在生物體內(nèi)的生物富集作用的大小。生物富

7、集系數(shù)是描述化學(xué)物質(zhì)在生物體內(nèi)累積趨勢之重要指標(biāo)。,6 鎘含量的測定 按上述方法，差速離心法下得到各種細胞器，細胞壁、細胞器組分用1:4 ( v/v) 的hno3-hclo4 混合消煮, 消煮完全后, 定容、過濾, 用石墨爐原子吸收分光光度計測定各組分鎘含量。細胞質(zhì)組分和可溶部分的各流分無需消化, 直接用石墨爐原子吸收分光光度計測定鎘含量。7 鋅的測量（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6個25ml容量瓶，分別加入5滴1:1鹽酸，依次加入0.00,0.50,1.00,2.00，3.00，4.00ml的濃度為10mg/l的鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，配成含0.00,0.20,0.40,0.80,1.20,1.60mg/l的鋅標(biāo)準(zhǔn)系列，然后用帶有鋅空心陰極燈（213.9nm）的原子吸收分光光度計測定其吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2） 消化：同上述消化步驟。（3） 測定：將消