1、1,第十七章 色譜分析法概論 chromatography,分析化學(xué)教研室 李發(fā)美教授,2,色譜法的分類和發(fā)展 色譜過程和基本原理 基本類型色譜方法及其分離機(jī)制 色譜法基本理論,3,4,高分離效能、高靈敏度、高選擇性、 分析速度快、 應(yīng)用范圍廣,色譜法的特點(diǎn):,5,色譜學(xué)的重要作用,諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：1948年，瑞典Tiselins，電泳和吸附分析；1952年，英國馬丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色譜。 應(yīng)用的科學(xué)領(lǐng)域：生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等。（科學(xué)的科學(xué)） 藥學(xué)（藥物分析）：各國藥典收載了許多色譜分析方法。中國藥典二部，700多，純度檢查、定性鑒別或含量測(cè)定，一部，600多

2、鑒別或含量測(cè)定。,6,第一節(jié) 色譜法的分類和發(fā)展,一、色譜法的分類 按流動(dòng)相的分子聚集狀態(tài)分類: GC、LC、SFC 等 按固定相的分子聚集狀態(tài)分類: GSC、GLC、LSC、LLC等 按操作形式分類: 柱色譜法、平面色譜法、毛細(xì)管電泳法等 按色譜過程的分離機(jī)制分類: 分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、 空間排阻色譜法、毛細(xì)管電泳法等,7,8,二、色譜法的發(fā)展 （一）色譜法的歷史 （二）色譜法的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 1新型固定相和檢測(cè)器的研制 2色譜新方法的研究 3色譜聯(lián)用技術(shù) 4色譜專家系統(tǒng),9,第二節(jié) 色譜過程和基本原理,一、色譜過程 實(shí)現(xiàn)色譜操作的基本條件是必須具備相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相，固定相

3、(stationary phase)和流動(dòng)相(mobile phase)。 色譜過程是組分的分子在流動(dòng)相和固定相間多次“分配”的過程。,10,11,色譜過程,組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異 與固定相作用差異 隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度不等 差速遷移 色譜分離。,12,13,二、色譜流出曲線和有關(guān)概念,色譜流出曲線是由檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖所繪制的曲線，又稱為色譜圖。 基線是在操作條件下，沒有組分流出時(shí)的流出曲線。基線反映儀器 (主要是檢測(cè)器) 的噪音隨時(shí)間的變化。 色譜峰是流出曲線上的突起部分。 正常色譜峰、拖尾峰和前延峰,14,對(duì)稱因子fs (symmetry factor) ： 衡量色譜峰的對(duì)

4、稱性,15,到20頁,到19頁,16,保留時(shí)間(retention time;tR)：從進(jìn)樣到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的時(shí)間間隔。 死時(shí)間 (t0)：分配系數(shù)為零的組分，即不被固定相吸附或溶解的組分的保留時(shí)間。 調(diào)整保留時(shí)間 ( )：某組分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的組分在柱中多停留的時(shí)間。,定性參數(shù)1,17,定性參數(shù)2 保留體積(VR)：從進(jìn)樣開始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)，所需通過色譜柱的流動(dòng)相體積。,死體積(V0)：由進(jìn)樣器至檢測(cè)器的流路中未被固定相占有的空間。 固定相顆粒間間隙、導(dǎo)管的容積、檢測(cè)器內(nèi)腔容積的總和。,18,定性參數(shù)3 調(diào)整保留體積(adju

5、sted retention volume; )：由保留體積扣除死體積后的體積,相對(duì)保留值(r) ：兩組分的調(diào)整保留值之比,注意：VR是定值，tR與FC成反比,19,定量參數(shù) 峰高(peak height；h)：組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的檢測(cè)信號(hào)，即色譜峰頂至基線的距離。 峰面積(peak area；A)：色譜曲線與基線間包圍的面積。,返回,20,柱效參數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation；)：正態(tài)色譜流出曲線上兩拐點(diǎn)間距離之半，即0.607倍峰高處的峰寬之半。 的大小表示組分被帶出色譜柱的分散程度。越大，組分越分散；反之越集中。 半峰寬 (W1/2)：峰高一半處的峰寬。 W1/2

6、=2.355 峰寬 (peak width；W)：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)作切線在基線上所截得的距離。 W=4 或W=1.699W1/2,返回,21,總分離效能指標(biāo) 分離度(resolution；R)：又稱分辨率。是相鄰兩色譜峰保留時(shí)間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。,22,分離度,設(shè)正常峰，W1W2= 4 ， 則R=1.5時(shí)，99.7%面積(tR 3)被分開， tR =6 ，稱 6 分離 。,23,三、分配系數(shù)與色譜分離,(一) 分配系數(shù)和容量因子 分配系數(shù) (distribution coefficient；K)是在一定溫度和壓力下，達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相 (s) 與流動(dòng)相 (m) 中的濃度 (C

7、) 之比。,分配系數(shù)僅與組分、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)及溫度（和壓力）有關(guān)。是組分的特征常數(shù)。,24,容量因子(capacity factor；k)：在一定溫度和壓力下，達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量(m)之比。（摩爾數(shù)？） 又稱為質(zhì)量分配系數(shù)或分配比。,分配系數(shù)與色譜分離,還與固定相和流動(dòng)相的體積有關(guān)。,容量因子與分配系數(shù)的關(guān)系,25,tR=t0(1+ k) tR=t0(1+K ),分配系數(shù)與色譜分離,（二）分配系數(shù)和容量因子與保留時(shí)間的關(guān)系,v=L/tR,u=L/t0,26,（三）色譜分離的前提,KAKB 或kAkB 是色譜分離的前提。,= t0(1+KA ),= t0(1+KB

8、 ),tR= t0 (KAKB),tR0,KAKB kAkB,分配系數(shù)與色譜分離,推導(dǎo)過程：,27,第三節(jié) 基本類型色譜方法及其分離機(jī)制,分配色譜法 吸附色譜法 離子交換色譜法 空間排阻色譜法,28,一、分配色譜法,29,分配色譜法,分離原理 利用被分離組分在固定相或流動(dòng)相中的溶解度差別而實(shí)現(xiàn)分離。,溶質(zhì)分子在固定相中溶解度越大，或在流動(dòng)相 中溶解度越小，則K越大。在LLC中K主要與流 動(dòng)相的性質(zhì) (種類與極性) 有關(guān)；在GLC中K與 固定相極性和柱溫有關(guān)。,30,分配色譜法,固定相 又稱固定液（涂漬在惰性載體顆粒上的一薄層 液體；化學(xué)鍵合相（通過化學(xué)反應(yīng)將各種有機(jī) 基團(tuán)鍵合到載體上形成的固定

9、相）。 流動(dòng)相 氣液分配色譜法：氣體，常為氫氣或氮?dú)狻?液液分配色譜法：與固定相不相溶的液體。 正相液液分配色譜：流動(dòng)相的極性弱于固定相的極性。 反相液液分配色譜：流動(dòng)相的極性強(qiáng)于固定相的極性。,31,分配色譜法,洗脫順序 由組分在固定相或流動(dòng)相中溶解度的相對(duì)大小而決定。,正相液液分配色譜：極性強(qiáng)的組分后被洗脫。 （庫侖力和氫鍵力）,反相液液分配色譜：極性強(qiáng)的組分先出柱。,32,二、吸附色譜法,分離原理 利用被分離組分對(duì)固定相表面吸附中心吸附能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離。 吸附過程是試樣中組分的分子(X)與流動(dòng)相分子(Y)爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心的過程，即為競(jìng)爭(zhēng)吸附過程 。,33,34,吸附系數(shù)與吸附劑

10、的 活性、組分的性質(zhì)和 流動(dòng)相的性質(zhì)有關(guān)。,35,吸附色譜法,固定相 多為吸附劑，如硅膠、氧化鋁。 硅膠表面硅醇基為吸附中心。 經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜：一般硅膠 高效液相色譜：球型或無定型全多孔硅 膠和堆積硅珠。 氣相色譜：高分子多孔微球等,36,吸附色譜法,流動(dòng)相 有機(jī)溶劑（硅膠為吸附劑） 洗脫能力：主要由其極性決定。 強(qiáng)極性流動(dòng)相占據(jù)吸附中心的能力強(qiáng)，洗脫能力強(qiáng)，使k值小，保留時(shí)間短。 Snyder溶劑強(qiáng)度o：吸附自由能，表示洗脫能力。o值越大，固定相對(duì)溶劑的吸附能力越強(qiáng)，即洗脫能力越強(qiáng)。,37,表 17-1 一些溶劑在硅膠上的o值,38,吸附色譜法,洗脫順序 ka=KaSa/Vm 在色

11、譜柱（Sa與Vm一定）時(shí)，Ka大的組分保留強(qiáng)，后被洗脫，Ka小的組分在吸附劑上保留弱，先被洗脫。 Ka與組分的性質(zhì)（極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型有關(guān)）。,39,以硅膠為吸附劑：極性強(qiáng)的組分吸附力強(qiáng)。 飽和碳?xì)浠衔餅榉菢O性化合物，不被吸附?；灸负讼嗤氲娜〈鶚O性越強(qiáng)，則分子的極性越強(qiáng)，吸附能力越強(qiáng)；極性基團(tuán)越多，分子極性越強(qiáng) (但要考慮其他因素的影響) 。 不飽和化合物的吸附力強(qiáng)，雙鍵數(shù)越多，吸附力越強(qiáng)。 分子中取代基的空間排列,40,三、離子交換色譜法,分離原理 利用被分離組分離子交換能力的 差別而實(shí)現(xiàn)分離。 分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。 陽離子交換： 陰離子交換： 離

12、子交換通式：,交換,再生,+,+,3,RNR+,OH-,Cl,RNR+,3,Cl,OH,交換,再生,+,+,RSO,H+,Na+,Na+,+,3,3,H,RSO,41,四、空間排阻色譜法,分離原理根據(jù)被分離組分分子的線團(tuán)尺寸 進(jìn)行分離。 也稱為分子排阻色譜法。,42,43,空間排阻色譜法,根據(jù)空間排阻（steric exclusion）理論，孔內(nèi)外同等大小的溶質(zhì)分子處于擴(kuò)散平衡狀態(tài)： 滲透系數(shù)： Kp =Xs/Xm （0Kp1 ） 由溶質(zhì)分子的線團(tuán)尺寸和凝膠孔隙的大小所決定。在一定分子線團(tuán)尺寸范圍內(nèi)，Kp與分子量相關(guān)，即組分按分子量的大小分離。,44,空間排阻色譜法,固定相多孔凝膠：軟質(zhì)、半軟

13、質(zhì)和硬質(zhì) 主要性能參數(shù) 平均孔徑 排斥極限（Kp=0）：不能滲透進(jìn)入凝膠的任何孔隙最低分子量 分子量范圍：排斥極限（Kp=0）與全滲透點(diǎn)（Kp=1）之間的分子量范圍圍。選擇凝膠時(shí)應(yīng)使試樣的分子量落入此范圍。,45,空間排阻色譜法,流動(dòng)相 要求：能溶解試樣、潤濕凝膠，粘度要低 水溶性試樣選擇水溶液為流動(dòng)相(稱為凝膠過濾色譜gel filtration chromatography； GFC)； 非水溶性試樣選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑為流動(dòng)相 (凝膠滲透色譜gel permeation chromatography；GPC)。,46,空間排阻色譜法,保留體積與滲透系數(shù)的關(guān)系,

14、VmV0,分子線團(tuán)尺寸（分子量）大的組分， 其滲透系數(shù)小，保留體積也小， 因而先被洗脫出柱。,47,小結(jié),色譜過程方程式： 分配系數(shù)大的組分保留時(shí)間長（保留體積大），晚流出色譜柱。 K在分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜和凝膠色譜中，分別為狹義分配系數(shù)K、吸附系數(shù)Ka、選擇性系數(shù)KA/B和滲透系數(shù)Kp， Vs分別為色譜柱（或薄層板）內(nèi)固定液體積、吸附劑表面積、離子交換劑總交換容量和凝膠孔內(nèi)總?cè)莘e。,48,第四節(jié) 色譜法基本理論,49,要使R大，必須： 1、tR大- k大-熱力學(xué) 2、W小-峰展寬小-動(dòng)力學(xué),50,色譜理論包括兩方面: 熱力學(xué)理論：研究分配(分離)過程，塔板理論（plate the

15、ory）。 動(dòng)力學(xué)理論：研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響，速率理論（rate theory）。,51,一、塔板理論,始于馬?。∕artin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。 分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。 色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。,52,塔板理論假定：,在色譜柱內(nèi)每一“塔板”H內(nèi)，組分在兩相間瞬間達(dá)到分配平衡。 流動(dòng)相間歇式進(jìn)入色譜柱，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。 分配系數(shù)在各塔板內(nèi)是常數(shù)。 縱向擴(kuò)散可以忽略。,53,（一）質(zhì)量分配和轉(zhuǎn)移,1、單一組分B（kB=0.5）的分配和轉(zhuǎn)移 設(shè)色譜柱的塔板數(shù)n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）號(hào)

16、。 將單位質(zhì)量的B加到第0號(hào)塔板上。 分配平衡后，0號(hào)塔板內(nèi)ms/mm 0.333/0.667。 進(jìn)入一個(gè)塔板體積的流動(dòng)相（一次轉(zhuǎn)移），,54,55,經(jīng)過N次轉(zhuǎn)移后，質(zhì)量分布符合二項(xiàng)式(ms+mm)N的展開式。,如N=3，展開式為： (0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296,0 1 2 3號(hào),在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量分布由k(K)決定,56,轉(zhuǎn)移N次后，第r號(hào)塔板中的質(zhì)量Nmr：,57,例：轉(zhuǎn)移3次后，在第2號(hào)塔板內(nèi)的溶 質(zhì)分?jǐn)?shù),58,組分B(kB=0.5)在n=5的色譜柱內(nèi)及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0

17、.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.099 0.269 0.395 0.198 0 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.132 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.219 7 0 0.006 0.038 0.128 0.256 0.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.01

18、6 0.056 0.068,59,注意： 1、柱出口處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算。 2、質(zhì)量（濃度）最大點(diǎn)的N，即保留體積。,60,2、兩組分的分離,A(kA=1)和B(kB=0.5)兩組分,61,組分A(kA=1)在n=5的色譜柱內(nèi)和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0 0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016

19、 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.137 9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124,62,結(jié)果：,組分B: k=0.5, 當(dāng)N=6和7時(shí)，柱出口產(chǎn)生B的濃度最大點(diǎn)。 組分A：k=1，N=8和9時(shí)，柱出口處達(dá)到濃度最大點(diǎn)。,兩組分開始分離， k小的組分B在柱后先出現(xiàn)濃度極大值, 即先出柱。,63,一根色譜柱n=103

20、以上，組分有微小的分配系數(shù)(容量因子)差別即可實(shí)現(xiàn)完全分離。 分配系數(shù)(容量因子)不等是分離的前提。,64,(二) 流出曲線方程,1、二項(xiàng)式分布曲線 以組分A在柱出口處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)N作圖。,65,N 柱出口 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0.032 6 0.079 7 0.118 8 0.137 9 0.137 10 0.124,k=1的組分從n=5色譜柱中的流出曲線圖,66,2、色譜流出曲線 當(dāng)塔板數(shù)很大時(shí)，流出曲線趨于正態(tài)分布曲線。,67,68,3、色譜流出曲線方程（正態(tài)分布方程） 描述組分流出色譜柱的濃度變化：,為標(biāo)準(zhǔn)差，tR為保留時(shí)間，C為任意時(shí)間t時(shí)的濃度，C0為峰面積

21、A，即相當(dāng)于某組分的總量。,69,t=tR時(shí)，C有極大值：,Cmax即流出曲線的峰高h(yuǎn)。 一定時(shí)， 峰高h(yuǎn)取決于C0。 C0一定時(shí)， 峰高h(yuǎn)取決于。,70,流出曲線方程的常用形式：,不論ttR或ttR時(shí)，濃度C恒小于Cmax。 C隨時(shí)間t向峰兩側(cè)對(duì)稱下降。 越小，峰越銳。 是柱效的標(biāo)志。,71,色譜峰面積,以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355 ，,峰面積:,A=h (2 )1/2,A=1.065W1/2h,色譜定量的參數(shù),72,(三) 理論塔板高度和理論塔板數(shù) (height equivalent to a theoretical plate或plate height, H)

22、(plate number, n),是色譜柱效參數(shù)。,73,理論塔板數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差（峰寬或半峰寬）和保留時(shí)間的關(guān)系：,74,理論塔板高度 H =L/n,注意： 1、計(jì)算n時(shí)使標(biāo)準(zhǔn)差（峰寬或半峰寬）和保留時(shí)間單位一致 2、n的單位,75,有效理論塔板數(shù)和有效理論塔板高度,Hef =L/nef,76,小結(jié),塔板理論解釋了流出曲線的形狀 說明了組分的分配和分離過程 提出了評(píng)價(jià)柱效的指標(biāo) 但某些假設(shè)與實(shí)際色譜過程不符,77,二、速率理論,塔板理論的不足： 組分在兩相中不可能真正達(dá)到分配平衡； 組分在色譜柱中的縱向擴(kuò)散不能忽略; 沒有考慮各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)傳質(zhì)過程的影響； 無法解釋柱效與流動(dòng)相流速的關(guān)系； 不能說明影響柱效有哪些主要因素。,78,速率理論,1956年，荷蘭學(xué)者范第姆特(Van Deemter)提出了色譜過程動(dòng)力學(xué)理論速率理論。,塔板高度,渦流擴(kuò)散項(xiàng),縱向擴(kuò)散項(xiàng),傳質(zhì)阻