1、RNA-seq技術(shù)原理和應(yīng)用，報告人：柳曉東2012.4.16，1，RNA-seq技術(shù)簡介2，RNA-seq技術(shù)原理3，RNA-seq技術(shù)優(yōu)勢4，RNA-seq技術(shù)優(yōu)勢或RNA序列也被稱為轉(zhuǎn)錄組序列，mRNA 一種利用高吞吐量測量序列技術(shù)對小型RNA和非編碼RNA (NC RNA )的全部或一部分進行序列分析的技術(shù)。 轉(zhuǎn)錄組的意思：轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞球在某種發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非查詢密碼RNA(non-coding RNA，ncRNA )。 轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，對于解讀染色體組功能的原件、闡明細(xì)胞球及組織分子組成是必要的

2、。 關(guān)于ncRNA、ncRNA的一些知識：非查詢密碼RNA(ncRNA )主要具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)波特酒RNA(tRNA )、核糖體RNA(rRNA )、小核RNA(snRNA )、以及非查詢密碼化RNA對基因的表達的作用，如對染色體結(jié)構(gòu)的影響、rnna 近年來，利用RNA-seq進行序列分析的多篇文章中包含了ncRNA的分析，發(fā)現(xiàn)了很多新的ncRNA。 二、RNA-seq技術(shù)原理、RNA-seq實驗程序流程圖，首先得到細(xì)胞球總RNA，然后根據(jù)實驗的需要，例如測定mRNA、ncRNA、smallRNA等，對RNA樣本進行處理。 處理后的RNA進一步碎片化，進行逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，獲取cDNA實時拉力賽，

3、將連接器連接到cDNA片段的兩端，最后以下一代高通量測量序列進行測序。 所謂高通量測定序列、高通量測定序列技術(shù)(High-throughput sequencing )，能夠一次并行測定數(shù)十萬到數(shù)百萬個DNA分子的序列，每個序列測定的讀取長度一般是短的序列高吞吐量測量序列技術(shù)給傳統(tǒng)序列帶來了革命性的變化，同時對數(shù)十萬到數(shù)百萬的DNA分子進行序列測量，因此在某些文獻中被稱為下一代序列技術(shù)(next generation sequencing )， 高吞吐量測量序列使云同步能夠?qū)δ硞€轉(zhuǎn)錄組和染色體組進行細(xì)致的整體分析，對三種高吞吐量測量序列進行了概述： 2005年以來，新一代的測序儀標(biāo)記了Roch

4、e公司的454項技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)此后，Helicos Biosciences公司又發(fā)布了單分子序列測定(SMS )技術(shù)。 3種高通量測量序列技術(shù)的優(yōu)缺點，高通量測量序列中重要名詞的解釋，1，定序深度：定序所得總堿數(shù)與待測染色體組大小之比。 設(shè)一個基因組大小為7M，測序總堿基數(shù)為70M，測序深度為10。 2 .展望：通過序列確定得到的序列占染色體組整體的比例。 由于存在染色體組中的高GC含量、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，序列確定的最終史迪奇組裝序列往往不能復(fù)蓋所有區(qū)域，這些個區(qū)域稱為Gap。 兩者的關(guān)系：序列深度和染色體組的展望度之間存在正相關(guān)關(guān)系

5、，序列錯誤率和假陽性結(jié)果隨著序列深度的提高而降低。 如果序列決定深度在1015X以上，就能保證控制基因組的展望度和序列決定錯誤率。3、rpkm (readsperkilobasepermillionreads )是每百萬個讀段中從某個基因開始每千個堿基長度的讀段數(shù)。 其公式為：total exon reads指被某基因映射的reads數(shù)，mapped reads指從map到所有基因的總reads數(shù)。 RPKM不僅規(guī)范了測序深度，而且規(guī)范了基因長度，因此不同長度的基因在不同測序深度得到的基因表達水平估計值具有可比性，是目前最常用的基因表達估計方法。三、RNA-seq技術(shù)的優(yōu)越性在于，相對于傳統(tǒng)的

6、sanger測序方法，RNA-seq具有以下優(yōu)勢： 1、數(shù)字化信號：直接測量各傳輸手抄本片段序列、一元酸極限分辨率精度，并且是傳統(tǒng)微陣列單孢雜交的熒光模擬2 .靈敏度高：稀有的轉(zhuǎn)發(fā)手抄本，可檢測出細(xì)胞球中的至少幾個拷貝。 3 .任意種類的全染色體組分析：由于不需要設(shè)定和修正特異的探針，所以不需要知道種類的基因信息，可以對任何種類進行直接轉(zhuǎn)印組分析。 能夠在云同步中檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄手抄本，正確識別可變剪切位點和cSNP、UTR區(qū)域。SAGE、序列分析、基因表達系列分析MPSS、massivelyparallelsignaturesequencing、大規(guī)模殘奧信號序列分析、4、rna-

7、。 1、轉(zhuǎn)錄手抄本結(jié)構(gòu)的研究利用單鹽化學(xué)基極限分辨率的RNA-Seq技術(shù)，可以使基因注釋多方面的內(nèi)容極為豐富，包括5/3邊界鑒定、UTRs區(qū)域鑒定及新的轉(zhuǎn)錄區(qū)域鑒定等。 RNA-Seq也可以對可變拼接進行定量研究。 2 .遺傳手抄本變異研究在發(fā)現(xiàn)序列差異方面，如融合基因鑒定、查詢密碼序列多態(tài)性的研究等，RNA-seq也有很大的潛力。 3、非查詢密碼領(lǐng)域功能研究轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要方面之一是ncRNA的發(fā)現(xiàn)與分析。 ncRNA根據(jù)其功能分為留守ncRNA和調(diào)節(jié)ncRNA。 前者通常表達穩(wěn)定，對細(xì)胞球存活發(fā)揮重要的一系列功能，主要包括轉(zhuǎn)移RNA(tRNA )、核糖體RNA(rRNA )、小核RNA(

8、snRNA )及小核RNA(snoRNA )等。 后者主要包括以長鏈ncRNA(lncRNA )和microRNA為代表的小ncRNA(small ncRNA )，在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多方面調(diào)控基因表達。 4、基因表達水平的研究與以往的芯片技術(shù)相比，RNA-Seq技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地確定細(xì)胞球中RNA的表達水平。 原則上，RNA-Seq決定了細(xì)胞球群中每一分子的絕對數(shù)量，可以直接比較實驗間的結(jié)果。 RNA-Seq的一個特別強大的好處是，可以捕獲不同組織或狀態(tài)下的轉(zhuǎn)移組的動態(tài)變化，而無需復(fù)雜地標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)定徑套。 5、低豐度新轉(zhuǎn)手抄本的確定可以利用轉(zhuǎn)位子標(biāo)簽和芯片技術(shù)獲得新的轉(zhuǎn)手抄本，但是工作量太大，結(jié)果不確定。 RNA-Seq不被本底噪聲問題所困擾，結(jié)果的精準(zhǔn)性高，因此被用于發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)發(fā)手抄本。 近年來，釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、擬南芥、水稻、小鼠、人白念珠菌轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果均顯示大量新的轉(zhuǎn)錄區(qū)，其中多數(shù)轉(zhuǎn)錄水平低于已知的cDNA基因。 RNA-seq序列數(shù)據(jù)的分析、五、RNA-seq的發(fā)展前景、RNA-seq相對于傳統(tǒng)序列方法