1、.,1,資料收集： PPT制作： PPT演講：,微生物生產(chǎn)抗生素類(lèi)藥,.,2,目錄,.,3,一. 抗生素定義,傳統(tǒng)的定義：抗生素（antibiotic）是微生物細(xì)胞產(chǎn)生的能以低濃度抑制其他微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)。 現(xiàn)代定義：抗生素是生物細(xì)胞（包括某些微生物植物和動(dòng)物）產(chǎn)生的能以低濃度抑制其他生物細(xì)胞生長(zhǎng)或功能的化學(xué)物質(zhì)。,.,4,概 述,抗生素是某些生物產(chǎn)生的具有生物活性的物質(zhì)，它不但可以抑制其他微生物的發(fā)育與代謝，有的還可以抑制癌的發(fā)育與代謝，及具有抗血纖維蛋白溶酶作用。 抗生素是人們使用最多的藥物，也是制藥工業(yè)中利潤(rùn)最高的產(chǎn)品。世界各國(guó)由發(fā)酵法生產(chǎn)的抗生素約400種，廣泛應(yīng)用的僅120種

2、，其他主要是毒性大、成本高，無(wú)商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 抗生素生產(chǎn)為近代微生物技術(shù)中最大產(chǎn)業(yè)之一，世界產(chǎn)量超過(guò)35000噸，不但在經(jīng)濟(jì)上占有重要位置，且為人類(lèi)健康作了出巨大貢獻(xiàn)。,.,5,概 述,第二次世界大戰(zhàn)期間 ,英美科學(xué)家在早年 Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素的基礎(chǔ)上 ,共同進(jìn)行了青霉素的開(kāi)發(fā) ,用紫外光照射處理低產(chǎn)菌種 ,提高其產(chǎn)青霉素的能力 ,采用玉米漿作為培養(yǎng)基的氮源 ,從而成功地開(kāi)始了青霉素的工業(yè)生產(chǎn) ,并建立了深層發(fā)酵技術(shù) ,這是發(fā)酵工業(yè)的一次革命 ,成為抗生素生產(chǎn)的開(kāi)端。 抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是利用微生物發(fā)酵法，極少數(shù)抗生素如磷霉素可用法學(xué)法生產(chǎn)。此外還用天然產(chǎn)生的抗生素進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，

3、制造各種衍生物。,.,6,二、抗生素的生物來(lái)源,微生物產(chǎn)生抗生素,1、放線菌產(chǎn)生的抗生素： 鏈霉菌屬：放線菌素、鏈霉素等。 小單抱菌屬：紅霉素（大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)）、新霉素（氨基環(huán)醇類(lèi)） 諾卡氏菌屬：肌霉素（氨基環(huán)醇類(lèi)）、諾卡氏菌素 放線菌中以鏈霉菌屬產(chǎn)生的抗生素最多，諾卡菌屬較少。,2、細(xì)菌產(chǎn)生抗生素 芽孢桿菌屬：多粘芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌 假單胞菌屬：銅綠假單胞菌（綠膿桿菌） 桿菌肽、粘桿菌素、多黏菌素等多肽類(lèi)。 3、真菌產(chǎn)生抗生素 青霉屬：青霉素、灰黃霉素。 頭孢菌屬： 頭孢霉素,.,9,其他生物（動(dòng)植物）產(chǎn)生抗生素,植物產(chǎn)生的抗生素，如地衣和藻類(lèi)植物產(chǎn)生的地衣酸和綠藻酸，從被子植物如蒜和番茄等

4、植物的組織或果實(shí)中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如銀杏、紅杉等也能產(chǎn)生抗生物質(zhì)。 動(dòng)物的多種組織能產(chǎn)生溶菌酶或一些抗生素，如從動(dòng)物的心、肺、脾、腎、眼淚、涎水中可提取出色素，有抗菌及抗病毒等作用。,三、抗生素產(chǎn)生菌的選育 1、抗生素產(chǎn)生菌的分離 2、抗菌性試驗(yàn) 3、抗生素產(chǎn)生菌的改良 1)人工誘變 2)原生質(zhì)體融合 3)體外DNA重組,體外DNA重組,四、抗生素的提純,微生物在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，包括各種初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物以及培養(yǎng)基的固有成分，這些成分的存在影響抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成儲(chǔ)存困難，必須經(jīng)過(guò)精制。,抗生素提純的基本步驟和原則 3個(gè)基本步驟：發(fā)酵液過(guò)濾

5、和預(yù)處理、粗純化、精制 4個(gè)原則：時(shí)間盡量短；采用適當(dāng)較低濃度；條件適宜，pH適度，溫度適宜；防止雜菌污染。 提取方法： 吸附、萃取、離子交換、沉淀、色譜分離、分子篩過(guò)濾、透析等。,抗生素的提純,五、青霉素的發(fā)酵工藝,1、青霉素的作用機(jī)制、抗菌譜及穩(wěn)定性,作用機(jī)制：抑制細(xì)菌的轉(zhuǎn)肽酶，阻止細(xì)胞壁合成中的交叉連接步驟，使處于繁殖分裂期的細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)生障礙，導(dǎo)致菌體細(xì)胞壁損壞，使細(xì)胞內(nèi)因滲透壓等原因發(fā)生溶解而死亡。 抗菌譜：作用于大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌及部分革蘭氏陰性細(xì)菌。 穩(wěn)定性：弱酸性的有機(jī)化合物，干燥純凈的青霉素鹽很穩(wěn)定，pH5-7，6最穩(wěn)定。,.,16,2、菌種,青霉素作為第一個(gè)具有臨床

6、應(yīng)用價(jià)值的抗生素，1928年被發(fā)現(xiàn)，1943年在美國(guó)被首次實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。 最早發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生青霉素的原始菌種是點(diǎn)青霉菌，生產(chǎn)能力很低，發(fā)酵單位2U/mL，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求，所以被淘汰。現(xiàn)在主要采用的是產(chǎn)黃青霉菌，目前國(guó)際上青霉素生產(chǎn)最高發(fā)酵單位80000-90000U/mL.,.,17,2、菌種,生產(chǎn)菌種按其在深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)分為：絲狀菌和球狀菌；根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌。常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉菌。,為了提高產(chǎn)黃青霉菌的青霉素產(chǎn)量，使用誘變劑如：二環(huán)氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸、X射線等。,.,18,3、當(dāng)前青霉素的生產(chǎn)工藝流程,一般而言，

7、青霉素的生產(chǎn)工藝流程需要有四個(gè)環(huán)節(jié) 。 第一個(gè)環(huán)節(jié)是通過(guò)培養(yǎng)基配制、蒸汽滅菌等工藝手段將原料加工為一級(jí)種子罐。與此同時(shí)，還要將青霉素菌、 斜面母瓶、米孢子等經(jīng)過(guò)相應(yīng)處理后加入到一級(jí)種子罐中。 第二個(gè)環(huán)節(jié)是利用培養(yǎng)基配制和蒸汽滅菌等處理手段將原料培養(yǎng)成二級(jí)種子罐。第三個(gè)環(huán)節(jié)是在第二個(gè)環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)上加上發(fā)酵罐的處理，形成發(fā)酵液。最后一個(gè)環(huán)節(jié)則是將上述所獲得的發(fā)酵液放在帶放罐中，獲得最終的發(fā)酵液，完成青霉素的發(fā)酵制備 。,青霉素發(fā)酵工藝流程及發(fā)酵控制,.,20,（1）孢子制備,先將保存在砂土中的菌種孢子取出，在由甘油、葡萄糖以及蛋白胨所制備而成的培養(yǎng)基中進(jìn)行斜面培養(yǎng)，經(jīng)傳代和活化。培養(yǎng)溫度控制在26左

8、右（最利于菌種孢子傳代活化的適宜溫度）。培養(yǎng)7d左右，得到單菌落之后，再傳斜面，以同樣的方式培養(yǎng)7d。然后就可以將所獲得的斜面孢子移植到優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基上，25 ，相對(duì)濕度45%-50%，培養(yǎng)7d，得到最終的生產(chǎn)孢子。所獲得的生產(chǎn)孢子應(yīng)該經(jīng)過(guò)搖瓶試驗(yàn)后，確定其效價(jià)與雜菌情況均符合相關(guān)規(guī)定后方可用于下一環(huán)節(jié)生產(chǎn)。 可在孢子成熟后進(jìn)行真空干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿、碳酸鈣、玉米油、消沫劑等。 接種量： 200億孢子/噸培養(yǎng)基 空氣流量：1：3 （m3/m3min） 攪拌轉(zhuǎn)速：300-350 r/min pH：自然 溫度：271 時(shí)

9、間：40h,（2）種子罐培養(yǎng)工藝,.,22,（2）種子罐培養(yǎng)工藝,二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等 接種量：10% 空氣流量： 1：1-1.5 （m3/m3min） 攪拌轉(zhuǎn)速： 250-280 r/min pH：自然 溫度：251 時(shí)間：10-14h,.,23,（3）生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝,三級(jí)罐：發(fā)酵罐 培養(yǎng)基： 花生餅粉、葡萄糖、尿素、硝酸銨、硫代硫酸鈉、苯乙酰胺、碳酸鈣、玉米油、硅油 溫度控制：變溫控制，不同階段不同溫度 較高溫度（26），縮短生長(zhǎng)時(shí)間；降低溫度（22），利于青霉素合成。 pH：6.4-6.6左右 根據(jù)pH補(bǔ)糖（補(bǔ)糖可是pH上升） 空氣流量:

10、 1:0.8-1.5 （m3/m3min） 攪拌速度：150-200r/min,.,24,發(fā)酵罐示意圖,攪拌器,冷卻水進(jìn)口,放料口,無(wú)菌空氣,培養(yǎng)液,冷卻水出口,排氣口,pH檢測(cè)及 控制裝置,電動(dòng)機(jī),加料口,.,25,菌絲生長(zhǎng)速度與形態(tài)、濃度,發(fā)酵穩(wěn)定期，濕菌濃度可達(dá)15%-20%，絲狀菌干重約3%，球狀菌干重在5%左右。在發(fā)酵中后期一般每天放液一次，每次放掉總發(fā)酵液的10%左右。,.,26,消沫,天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵 前期：主間歇攪拌，少加油 中期：攪拌、加油、稍微降低通氣量（必要時(shí)，少量多次) 后期：盡量少加消沫劑,.,27,青霉素的發(fā)酵過(guò)程控制十分精密，一般2小時(shí)取樣一次，

11、測(cè)定發(fā)酵液的pH、菌濃、殘?zhí)?、青霉素效價(jià)等指標(biāo)，同樣取樣做無(wú)菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)染菌立即結(jié)束發(fā)酵，視情況過(guò)濾提取，因?yàn)槿揪髉H波動(dòng)大，青霉素在幾小時(shí)內(nèi)就會(huì)被全部破環(huán)。,.,28,(4)青霉素的提取工藝,青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活 水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定 易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小 青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性 防止降解，條件溫和、快速,青霉素的提取工藝,發(fā)酵液預(yù)處理萃取脫色反萃取過(guò)濾洗滌干燥 （發(fā)酵液中，青霉素濃度較低 10-30kg/m3） 發(fā)酵液預(yù)處理：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜志，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程 a. 加絮凝劑使蛋白質(zhì)沉淀 b. 過(guò)濾

12、（鼓式真空過(guò)濾機(jī)）,活性炭,萃取工藝過(guò)程：二級(jí)逆流萃取 A、萃取原理： 分配定律，青霉素在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有機(jī)溶劑中，青霉素鹽易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。 青霉素在濾液中以鹽存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有機(jī)相中，在醋酸丁酯中加入碳酸鉀，6.8-7.4，形成鹽轉(zhuǎn)入水相中，實(shí)現(xiàn)反萃取。,B、影響萃取因素 pH：反復(fù)調(diào)節(jié)pH，青霉素不穩(wěn)定，易發(fā)生降解、異構(gòu)化、重排，-內(nèi)酰胺環(huán)是功能性。 溫度：加熱會(huì)加快其降解反應(yīng) 工藝過(guò)程及濃縮倍數(shù)，級(jí)數(shù)越高、純度越高但收率越低。 微生物污染：雜菌：-內(nèi)酰胺酶和青霉素酰胺酶 萃取時(shí)間：青霉素在水中的半衰期18.5min。,(5)青霉素的精制 制成堿金

13、屬鹽：堿金屬鹽穩(wěn)定性大；青霉素在水中的穩(wěn)定性差，水解快。 1)結(jié)晶工藝： A、醋酸丁酯中直接結(jié)晶：加入醋酸鉀-乙醇-碳酸鉀、丁醇-水真空共沸蒸餾。 B、丁醇-水共沸結(jié)晶：青霉素的堿金屬鹽溶于水，在丁醇中不溶解，穩(wěn)定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇帶出水分，不斷加入丁醇，可使水分不斷減少，結(jié)晶析出。 2)過(guò)濾、洗滌、干燥 結(jié)晶后用真空抽濾來(lái)處理母液，并用丁醇洗滌。干燥采用真空雙錐旋轉(zhuǎn)干燥器,(6)溶媒回收 采用立式傳質(zhì)塔蒸餾回收。,.,34,一、斜面培養(yǎng)： 淀粉1，硫酸銨0.3、玉米粉0.61.0、氯化鈉0.3、蛋白胨0.2、瓊脂2、pH7.07.2 37培養(yǎng)710d，成熟的孢子灰色略帶微紅色

14、。 一級(jí)種子培養(yǎng)： 豆餅粉2.5、葡萄糖3、淀粉4、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸銨0.5、 、玉米粉0.2、氯化鈉0.3、磷酸氫二鉀0.06、硫酸鎂0.025、豆油0.3 35 培養(yǎng)72h，菌絲密集,六、紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn),二級(jí)種子： 豆餅粉2.2、葡萄糖3、淀粉4、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸銨0.1、玉米粉0.8、氯化鈉0.3、碳酸鈣0.6、豆油0.3 35，24h，接種量10 二、發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基： 豆餅粉2.4、葡萄糖3、3.5、蛋白胨0.5、酵母粉0.5、硫酸銨0.1、玉米粉0.8、氯化鈉0.3、碳酸鈣0.6、豆油0.15，丙酸0.6（分次加入） 60h前35，60h后3

15、3 ,菌絲繁殖期： 接種45h后，菌絲生長(zhǎng)快，繁殖旺盛，迅速利用N、C，菌絲體密集成網(wǎng)狀。 紅霉素分泌期： 45h150h，菌絲體生長(zhǎng)減弱，并達(dá)到平衡，pH在7.2左右，c源利用較快，紅霉素持續(xù)分泌。 菌絲自溶期： 菌體衰老，發(fā)酵液顏色較深，菌絲短，粘稠度較大，pH上升7.5，氨基氮上升。,三、紅霉素的提取和精制,紅霉素是一種有機(jī)堿化物，在堿性條件下溶于有機(jī)溶劑中，在酸性條件下溶于水中。,提取工藝,發(fā)酵液 過(guò)濾 濾液 酸化液,加甲醛、硫酸鋅,pH8.28.8,(26000 r/ml),加氫氧化鈉靜止,堿化,調(diào)節(jié)pH1010.5,分層、離心,醋酸調(diào)節(jié)pH55.5,靜止分層,酸化液,5加丙酮,冷凍結(jié)晶,結(jié)晶,洗滌,干燥,成品,1、發(fā)酵液預(yù)處理 0.10.2甲醛：殺菌使蛋白凝集變