1、細(xì)胞凋亡（ cell apoptosis）,細(xì)胞凋亡的概述,細(xì)胞凋亡（apoptosis）是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡，涉及一系列基因激活、表達(dá)以及調(diào)控等的主動過程，是機(jī)體為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動采取的一種死亡過程。 細(xì)胞凋亡是正常的生理過程： （1）是具有清除發(fā)生過程及成熟個體中多余細(xì)胞及老化細(xì)胞以調(diào)節(jié)機(jī)體的作用. （2）是具有消除對機(jī)體有害的癌細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞的機(jī)體防御作用。 但是凋亡過多或過少都可引起疾病發(fā)生！,細(xì)胞凋亡的特征,1.形態(tài)學(xué)特征： 胞膜完整，外形發(fā)泡狀， 胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器緊聚。 染色體緊縮呈月牙狀，凝聚在核膜周圍。 形成膜包的凋亡小體(apo

2、ptotic body)，被附近的細(xì)胞或巨噬細(xì)胞(M)吞噬消化清除。 細(xì)胞凋亡可發(fā)生在正常細(xì)胞群中的單個細(xì)胞。 2.生化特征： 胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高。細(xì)胞內(nèi)活性氧增多。質(zhì)膜通透性變大。DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段。型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）、半胱天冬蛋白酶（caspases）活性升高。磷脂酰絲氨酸外翻。,Apoptosis versus Necrosis,細(xì)胞凋亡的激發(fā)因素,Normal Cell,Apoptotic cell,細(xì)胞凋亡的抑制因素,線蟲體細(xì)胞凋亡研究： PCD相關(guān)基因15個，分為四組： 1、與PCD有

3、關(guān)的基因，負(fù)責(zé)PCD控制：ced-3、ced-4和ced-9。 2、與PCD過程吞噬作用有關(guān)：ced-1、ced-2、ced-5-8 和 ced-10。 3、核酸酶基因（nuc-1）, 控制DNA降解，但非PCD所必須。 4、影響特異細(xì)胞類型PCD的基因：ces-1、ces-2、cgl-1、和 her-1. 保守性高，在哺乳動物中有相應(yīng)同源物： Ced-3=ICE, Ced-4=Apaf-1, Ced-9=Bcl-2.,細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因以哺乳動物為例,凋亡促進(jìn)（apoptosis on）基因 凋亡促進(jìn)基因包括野生型P53，ICE，TGFB，F(xiàn)as，c-myc，Ced-3，

4、Ced-4，Bax 等。 凋亡抑制（apoptosis off）基因 凋亡抑制基因包括bcl-2，Rb，ced-9，突變型P53等。B,凋亡促進(jìn)（apoptosis on）基因,P53 為腫瘤的抑制基因，分為兩型：一型為野生型，可使細(xì)胞周期停止在G1 期，抑制細(xì)胞繁殖，誘導(dǎo)易感細(xì)胞發(fā)生凋亡；另一型為具有突變能力的變異型。 白介素1B 轉(zhuǎn)換酶（interlukin1-B-convertingenzyme，ICE），與線蟲細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Ced-3 有較高的同源性，具有直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 Fas為死亡受體，F(xiàn)as-L 是T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)物，F(xiàn)as 和Fas-L結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 癌基因c-my

5、c 是調(diào)控細(xì)胞周期的主要基因。研究表明，c-myc 在哺乳動物的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，它的過度表達(dá)既可使細(xì)胞周期變短、分裂增加，也可使細(xì)胞凋亡，這主要取決于能否獲得關(guān)鍵的生長因子。 Cleveland認(rèn)為，抑癌因素存在時，c-myc 促進(jìn)凋亡，而有致癌因素時，c-myc 促進(jìn)增殖。Bax 為Bcl-2 基因家族成員，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。,凋亡抑制（apoptosis on）基因,B 細(xì)胞淋巴瘤白血病基因2（B cell lymphomaleukemia gene 2，bcl-2）是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的原癌基因之一。 bcl-2、細(xì)胞色素C、細(xì)胞凋亡三者之間的關(guān)系：bcl-2 對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用

6、是一個關(guān)鍵因素，它能通過阻止細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的最后共同通道而抑制細(xì)胞凋亡。對哺乳動物能抑制多種細(xì)胞類型的細(xì)胞凋亡，抑制由多種因素引起的細(xì)胞凋亡。 突變型P53 喪失野生型P53 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，可抑制細(xì)胞凋亡。突變型P53 還可拮抗c-myc 引起的凋亡敏感性，從而對凋亡起到間接負(fù)調(diào)控作用。,BcL-2 family,Bc1-2（B cell lymphoma/leukemia-2，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2) 是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延長細(xì)胞的生存，能抑制細(xì)胞凋亡，而不是促進(jìn)細(xì)胞的增殖 。 Bcl-2家族已發(fā)現(xiàn)26個成員，所有Bcl

7、-2家族成員均含有1個或多個BH結(jié)構(gòu)域。蛋白含有4個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域，依次命 名為BHl、BH2、BH3和BH4。 可分為3個亞族：,Bcl-2亞家族, Bax亞家族, BH3亞家族,human prosurvival members (seven): Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl2l10, Bfl-1 and Bcl2l12 pro-apoptotic members (six): Bax, Bak, Bok, Bcl-G, Bcl-rambo and Bfk viral proteins (e.g. A52, K7) adopt a Bcl-2-li

8、ke fold BH3-only subfamily (10): Bid, Bad, Bik, Bim, Bmf, Noxa, Puma, Hrk, Beclin1 and MULE.,Bcl-2蛋白家族成員概況,Bcl-2 蛋白家族成員的相互作用與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,（1）影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能 （2）影響APAF1的功能,作用機(jī)制：,哺乳類細(xì)胞中Ced-3同源分子，1993年發(fā)現(xiàn)第1個Ced-3同源分子，叫白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)換酶（interleukin-1 converting enzyme，ICE）, 1994-1996年又不斷發(fā)現(xiàn)近10個，都具有促凋亡作用。1996年將這類分子統(tǒng)一定名為Ca

9、spase（cysteine containing specific protease，半胱天冬蛋白酶）。到1998年底為止共發(fā)現(xiàn)有14個Ced-3同源分子，分別定名為Caspase114。,半胱天冬蛋白酶類 （C-terminal aspartate proteases，Caspases）,Caspase分子的結(jié)構(gòu)特征,1. 以酶原形式存在,2. N端均含有一段P2P27的前區(qū)域，具有 嗜同性作用,3. 活性形式為雜四聚體（p17-20）2（p10-12）2,4. 大亞基的C端均含有活性中心QACXG（X=R、Q或G），其中C是必需的。,哺乳類細(xì)胞內(nèi)的Caspases的一級結(jié)構(gòu),按催化特異性

10、分：,Initiator caspases have a prodomain through which they can dimerize and self-activate by cleavage Caspases 2,8,9,10 Effector caspases are cleaved and activated by initiator caspases(caspase-3,6,7,14) Regulator caspases: regulation of initiator caspases1, 4, 11,（一)凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn)：包括DNA裂解為200bp左右的片段，染色質(zhì)

11、濃縮，細(xì)胞膜活化，細(xì)胞皺縮，凋亡小體。 激活蛋白激酶 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能 (二）破壞細(xì)胞抗凋亡因素 （1）激活蛋白激酶： including FAK, PKC, and Raf1. FAK disrupt cell adhesion for the apoptotic cell. （2）破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu) actin, and gelsilin. Cleavage and inactivation of these proteins lead to changes in cell shape.,Caspase的效應(yīng)機(jī)制,（3） 影響細(xì)胞周期的正常運行。 如分裂cyclin A，pRb

12、, P21, CdK1等導(dǎo)致細(xì)胞周期運行失常。 （4）影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能 Caspase可作用于多種與DNA，RNA功能有關(guān)的蛋白, 如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白，使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡。 （5）破壞細(xì)胞抗凋亡因素：ICAD （caspase-activated deoxyribonulease， CAD）,哺乳類細(xì)胞中Ced-4的同源分子，稱為細(xì)胞凋亡激活因子（apoptosis activating factors，Apafs ，1997年發(fā)現(xiàn)）,有Apaf-1, 2（cyt.c）, 3（pro-caspase-9）。人Apaf-1與Pro

13、-Caspase-9、Cytc形成復(fù)合體，稱為凋亡體（apoptosome），在ATP參與下凋亡體內(nèi)Pro-Caspase-9可自身激活形成活性的Caspase 9。,細(xì)胞凋亡激活因子類（Apafs）,人Apaf-1含1248個氨基酸（鼠源性的Apaf-1含1238個氨基酸），分子量130KD，基因定位12號染色體，其N端198位氨基酸組成CARD。,VDAC 和ANT 是線粒體外膜上最為豐富的兩種蛋白。最近有一些研究工作表明，VDAC和ANT可與Bc1-2家族蛋白相互作用，在細(xì)胞凋亡過程中介導(dǎo)對線粒體的損傷。VDAC本身是一種通道蛋白，它與Bax的結(jié)合可使共通道性能發(fā)生某種變化，這樣一些凋亡

14、蛋白如cyt.C 就可通過。因為這兩種蛋白在跨越線粒體膜的核苷酸和小分子轉(zhuǎn)運中起作用，所以它們與Bax的結(jié)合可能與細(xì)胞凋亡過程中線粒體ATP/ADP轉(zhuǎn)化和磷酸肌酸外運的抑制有關(guān)。,是baculoviruses病毒產(chǎn)物，抑制宿主細(xì)胞凋亡，以獲得更多的時間復(fù)制。 IAP超家族的成員較多，如c-IAP1, c-IAP2,XIAP, NIAP 和Survivin，新的成員在不斷的被發(fā)現(xiàn)。IAP家族成員有一個共同的特征，含有一個或多個個氨基酸的重復(fù)序列（BIR，結(jié)合和可逆性抑制caspases 活性），類似于zinc指狀的結(jié)構(gòu)。c-IAP1、 c-IAP2和 XIAP含有環(huán)指裝結(jié)構(gòu)（RING-finge

15、r- or a ubiquitin-conjugating (UBC)-domain） 。BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對caspase的抑制作用，而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用，介導(dǎo)caspase-3和-7的泛素化降解作用。,凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis ，IAP) 家族,IAP structural features,在細(xì)胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個新的N基端,這個N基端的前面4個氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合。Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合。Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對

16、caspase9的抑制，促進(jìn)凋亡。,Smac（second mitochondria activated caspase）/Dablo,P53與細(xì)胞凋亡,P53,GADD45,結(jié)合PCNA,結(jié)合RPA,TNF Fas從儲存處釋放出,Fas FasL DR5 Bax,Bcl-2,P21,阻止DNA修復(fù)和復(fù)制,細(xì)胞凋亡,阻止細(xì)胞周期在G1期,PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10）是隨P53以后呈現(xiàn)最高突變率的抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物，它主要催化PI-3，4，5-P3的肌醇3位上去磷酸形成PI-4，5-P2，拮抗PI-3

17、KinasePKB/Akt信號通路的抗凋亡作用。因為PKB具有磷酸化抑制Caspase 9、Bad的活性和抑制細(xì)胞色素C的釋放與Fas介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及通過FKHR間接抑制某些凋亡因子基因表達(dá)等作用，因此具有很強(qiáng)的抗凋亡作用。,張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）,PI-4,5-PI2,PI-3,4,5-P3,PDK,PKB,PKB,PTEN,p,PI3-K,p,T308 S470-P,CytC,Bad-s112-p,Caspase-9-s196-p,FKHR-s256-p,Fas denpendent apoptosis,Apoptosis,張力蛋白同源磷酸酯酶（PTEN）的促細(xì)胞凋亡機(jī)制

18、,病毒在感染宿主細(xì)胞后進(jìn)行病毒分泌(virocrine), 分泌的病毒因子中有些同源于細(xì)胞生長因子、生長因子受體或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，促進(jìn)宿主細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化，有些是阻止宿主細(xì)胞的凋亡防御，保護(hù)病毒的生存和免被消滅和清除。 1CrmA（cytokine response modifier A，細(xì)胞因子反應(yīng)修飾因子A）。這是牛痘病毒分泌的一種蛋白質(zhì)因子，分子量38KD，它具有抑制Caspase3和顆粒酶B（Granzyme B）活性而起到抗凋亡作用。,病毒因子,2P35:這是由桿狀病毒分泌的一種病毒因子，分子量35KD，其分子結(jié)構(gòu)與BcL-2部分同源，故具有抑制凋亡的作用。 3EIB55KD和EIB19

19、KD:均是腺病毒分泌的病毒因子，二者可分別結(jié)合P53和FLASH而抑制細(xì)胞凋亡。FLASH是最近報道的Pro-caspase-8結(jié)合FADD的竟?fàn)幮砸种品肿?，故有抑制Fas介導(dǎo)的凋亡作用）。,細(xì)胞凋亡途徑,死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑,線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑,一、死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑,參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白：死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（death domain protein）,TRADD：TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 TNF+TNFRI（死亡結(jié)構(gòu)域）+ TRADD細(xì)胞凋亡 FADD：Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 FasL+Fas （死亡結(jié)構(gòu)域） +FADD 細(xì)胞凋亡 RIP：受體相互

20、作用蛋白 CRADD：含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白 MADD：活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白,以FasL-Fas系統(tǒng)為例,Fas （factor associated suicide）：自殺相關(guān)因子是廣泛表達(dá)于正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞膜表面的型受體，其胞漿段內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）及阻抑結(jié)構(gòu)域（suppresive domain，SD）。Fas的阻抑結(jié)構(gòu)域（SD）被Fas結(jié)合磷酸酶-1（fas-associated phosphatase-1，F(xiàn)AP-1）結(jié)合后可抑制Fas的誘導(dǎo)凋亡作用。 2. FasL（fas Ligand）：Fas的配體主要表達(dá)于T效

21、應(yīng)淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，是呈現(xiàn)于膜表面的型受體。 Fas和FasL都是以純?nèi)垠w形成存在。,線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑,正常時線粒體外膜的通透性一般只允許5KD的小分子和離子進(jìn)出，當(dāng)受某些因素作用破壞了線粒體外膜的這種屏障性通透，引起膜間腔內(nèi)儲存的凋亡因子釋放入胞漿內(nèi)，立即啟動凋亡反應(yīng)。膜間腔內(nèi)的凋亡因子有：Cyt.c, 凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）, 第二個Caspase的線粒體激活因子（Smac）, Pro-caspase-2,-3,-7,-9和Hsp-10, Hsp-60等。,影響線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變的因素,1、BcL-2族的促凋亡亞族成員 （1）Bad： 在生長因子存在下，可通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI-3-K）和PKA促使Bad的Ser112，136磷酸化而抑制其促凋亡活性。在去除生長因子時，則Bad被去磷酸化而與Bcl-2或Bcl-XL二聚化，破壞線粒體外膜通透性釋放出凋亡分子而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 （2）Bid： 本來存在于胞漿內(nèi)，當(dāng)被Caspase 8催化分裂成N端11kD和C端15kD二個片段，后者即轉(zhuǎn)位線粒體破壞其外膜通透性而導(dǎo)致凋亡放大作