1、,第十六章 藥物分析中的新技術(shù)、新方法,手性分離色譜,一、手性藥物的現(xiàn)狀,手性藥物（579）,藥物（1992）,天然和半合成藥物（556）,合成藥物（1436）,非手性藥物（857）,單一異構(gòu)體（73）,外消旋體（506）,手性藥物（547）,非手性藥物（9）,單一異構(gòu)體（537）,外消旋體 （10）,二、手性藥物對(duì)映體的藥效學(xué)差異 1. 治療作用完全依賴一種異構(gòu)體 如：S(-)-甲基多巴 2. 藥理作用差別不大 如：異丙嗪 3. 藥理作用類似，但反應(yīng)強(qiáng)度有差別 4. 藥理與毒理作用存在“質(zhì)”的區(qū)別,二、手性藥物對(duì)映體的藥動(dòng)學(xué)差異 1. 吸收 2. 蛋白結(jié)合 3. 代謝,1. 間接法拆分對(duì)映異

2、構(gòu)體即衍生化試劑法（CDR） 2. 直接法拆分對(duì)映異構(gòu)體,手性固定相法（CSP）,手性流動(dòng)相添加劑法（CMP）,三、手性藥物拆分的高效液相色譜法分類,采用非手性固定相,四、拆分原理：,1. CDR,(R) SE +,(R) SA (R) SE (R) SA,(S) SA (R) SE (S) SA,手性衍生化特點(diǎn)： 需要高光學(xué)純度的手性衍生化試劑； 反應(yīng)繁瑣費(fèi)時(shí)； 衍生化反應(yīng)速率重現(xiàn)性較差 只需使用價(jià)格便宜、柱效較高的非手性柱 衍生化過(guò)程可同時(shí)純化樣品,柱前衍生化-反相高效液相色譜法 拆分酮洛芬對(duì)映異構(gòu)體,S-()-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬,酮洛芬對(duì)映體的柱前衍生化示意圖,酮洛芬對(duì)映體的柱前

3、衍生化方法,酮洛芬對(duì)照品溶液(1 mg/mL)0.1 mL,加入正己烷0.6 mL 二氯亞砜溶液 0.2 mL,冷卻至室溫,吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL,5 min,振搖,加入2.0 mol/L H2SO4 0.5 mL,混勻,吹干后溶解進(jìn)樣,色譜條件 色譜柱：Hypersil C18, 5 m, 1505.0mm ID， 流動(dòng)相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)， 流速： 1 ml/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm,酮洛芬對(duì)映體衍生化物色譜圖,R,S,酮洛芬對(duì)映體衍生化物的保留時(shí)間為tR=7.3 min，tR=8.5 min，分離度為1.9,2

4、. CSP,利用手性固定相與對(duì)映體消旋物相互作用，其中一個(gè)與手性固定相生成不穩(wěn)定的短暫的對(duì)映體復(fù)合物，使兩種異構(gòu)體在色譜柱上的保留時(shí)間不同，從而得到分離。,常用的手性固定相： 1. Pirkle型相 2. 合成多聚相 3. 環(huán)糊精鍵合相,特點(diǎn),適用范圍廣 制備分離方便 定量分析的可靠性高 價(jià)格昂貴,奈基乙脲鍵合硅膠柱拆分蘇氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的p-溴代苯甲酰胺衍生物對(duì)映體色譜圖,3. CMP,將手性試劑添加到流動(dòng)相中，利用手性試劑與藥物消旋物中各對(duì)映體結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)不同，以及藥物與結(jié)合物在固定相上分配的差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)映體的分離。,常用的手性添加劑： 1. 配基交換型手性添加劑 2. 手性離

5、子對(duì)絡(luò)合劑 3. 環(huán)糊精添加劑,特點(diǎn),可采用普通的非手性固定相 不需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化 手性添加物的可變范圍較寬,高效毛細(xì)管電泳 （HPCE）,HPCE是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的一種快速、高效的液相分離技術(shù)。具有以下特點(diǎn)： 1. 高效 2. 高速 3. 微量 4. 低消耗,毛細(xì)管電泳裝置示意圖,（一）基本原理：,v = veo+ vep = (eo+ep)E veo：電滲流速度 eo：電滲流淌度 vep：電泳流速度 ep：電泳流淌度 E： 電場(chǎng)強(qiáng)度,(),(+),電滲的產(chǎn)生,(),(+),毛細(xì)電泳中不同組分的遷移示意圖,（二）主要分離模式 1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） 2. 膠束動(dòng)電

6、毛細(xì)管色譜（MECC） 3. 毛細(xì)管凝膠電泳（CGE） 4. 毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）,1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 最基本、最廣泛的分離模式。 適用于所有具有不同淌度的荷電粒子的分離，但不能中性物質(zhì)及質(zhì)荷比相同的組分。,2. 膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜 用離子膠束溶液代替簡(jiǎn)單的緩沖溶液，使中性組分可按其疏水性的不同及在兩相間的分配系數(shù)的不同而分離。采用手性分配相，可用于手性化合物的分離。,3. 毛細(xì)管凝膠電泳 凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)溶質(zhì)具有分子篩的作用，可分離質(zhì)荷比相同但分子大小不同的組分。 在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)上有著十分廣泛的應(yīng)用。,4. 毛細(xì)管等電聚焦 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同而進(jìn)行分離。,pH梯度,高,

7、低,應(yīng)用： 1. 監(jiān)測(cè)藥物生產(chǎn)過(guò)程 如：監(jiān)測(cè)青霉素發(fā)酵液中有關(guān)物質(zhì)的量,青霉素發(fā)酵液的高效毛細(xì)管電泳圖 1. 青霉素G鈉 ；2. 6-APA ；3. 對(duì)羥基苯乙酸 ； 4. 鄰羥基苯乙酸 ；5. 苯乙酸,2. 中藥成分分析 如：黃酮及其甙類分析,黃芩中6種黃酮類成分的 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜分離圖 1.漢黃芩甙；2. 黃芩素；3.黃芩甙；4. 千層子素；5. 漢黃芩素；6.內(nèi)標(biāo)水楊酸；7.白楊素,3. 手性拆分 4. 體內(nèi)分析,質(zhì)譜法及其應(yīng)用,進(jìn)樣系統(tǒng),離子源,質(zhì)量分析器,檢測(cè)器,控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),真空系統(tǒng),一、離子源及離子化技術(shù) 1、EI（電子轟擊離子化）,電子轟擊質(zhì)譜示意圖,優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高

8、，有豐富的碎片離子信息和成熟的離子開裂理論，是結(jié)構(gòu)分析、鑒定的有力手段；重現(xiàn)性好，有標(biāo)準(zhǔn)圖譜，可以通過(guò)譜庫(kù)檢索對(duì)未知物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。 缺點(diǎn)： 樣品須汽化后才可離子化 適用化合物： 易揮發(fā)、熱穩(wěn)定化合物。,2、CI（化學(xué)離子化） 軟電離技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)： 可以得到較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰，有利于分子量的測(cè)定 缺點(diǎn)： 樣品須汽化后才可離子化 適用化合物： 易揮發(fā)、熱穩(wěn)定化合物,3、FAB（快原子轟擊離子化） 軟電離技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)： 樣品不須汽化；既給出化合物的分子量信息，又給出結(jié)構(gòu)信息。 適用范圍廣，儀器商品化較早，普及率高。 缺點(diǎn)： 重現(xiàn)性差，靈敏度較EI低。 適用化合物： 極性、高分子量、非揮發(fā)性及熱不穩(wěn)定化

9、合物。,快原子槍,樣品靶,原子束,質(zhì)量分析器,二次離子束,快原子轟擊質(zhì)譜示意圖,4、MALDI（基質(zhì)輔助激光解吸離子化） 軟電離技術(shù) 優(yōu)點(diǎn)： 通常只給出分子離子峰（或準(zhǔn)分子離子峰）。 適用化合物： 蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸等生物大分子,5、API（大氣壓離子化） 軟電離技術(shù) （1）ESI（電噴霧離子化） 特點(diǎn)： 能夠產(chǎn)生多電荷離子。 適用化合物： 對(duì)生物大分子及其他分子量大的化合物的分析較有利。,毛細(xì)管 + 4kV,含離子的液滴,隨液滴蒸發(fā)，電場(chǎng)加強(qiáng)，離子向表面移動(dòng),離子從表面蒸發(fā),離子蒸發(fā)機(jī)理,（2）APCI（大氣壓化學(xué)離子化） 最軟的電離方式之一 特點(diǎn)： 一般只給出化合物的分子量信息，通過(guò)源內(nèi)CID（碰撞誘導(dǎo)分解）可同時(shí)獲得結(jié)構(gòu)信息。