1、實(shí)驗二 培養(yǎng)基的制備,一、目的要求,1. 掌握培養(yǎng)基制備的原則； 2. 掌握培養(yǎng)基的制備方法。,二、實(shí)驗原理,1、培養(yǎng)基的概念？ 培養(yǎng)基是指由人工方法配合而成的營養(yǎng)基質(zhì)，專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存菌種用的混合營養(yǎng)物制品。,2、必須具備五個條件:,含有細(xì)菌生長所需的物質(zhì)： 如：水分、養(yǎng)分（氮源、碳源、礦物質(zhì)）等 適宜的酸堿性： 多數(shù)為pH7.2-7.6，有的為pH5.6-6.8 。 不含抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)； 均質(zhì)透明： 便于觀察細(xì)菌生長性狀和引起培養(yǎng)基的變化， 嚴(yán)格滅菌，保證無菌。,配好立即高壓滅菌，并保證新鮮。,3、培養(yǎng)基的分類,根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分：,

2、天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基。,根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：,固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基,根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：,增菌培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,中國農(nóng)業(yè)出版社陳天壽主編,一些物質(zhì)在培養(yǎng)基中的應(yīng)用原理,1.細(xì)菌生長的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)： N源：蛋白胨（peptone）、酵母浸出物 牛肉浸膏 C源 無機(jī)鹽類 水,一些物質(zhì)在培養(yǎng)基中的應(yīng)用原理,2.具有抑菌作用的物質(zhì) 抑制G-菌的：葡萄糖、亞硫酸鉍和煌綠 抑制G+菌的：結(jié)晶紫、膽鹽 抑制腸道非致病菌的：膽鹽,一些物質(zhì)在培養(yǎng)基中的應(yīng)用原理,3.具有生化反應(yīng)作用的 硫羥代乙酸鈉（硫乙醇酸鈉）、半胱氨酸、葡萄糖、肝塊、肉渣、還原鐵等還原

3、劑 生化反應(yīng),一些物質(zhì)在培養(yǎng)基中的應(yīng)用原理,4.具有緩沖作用的 磷酸鹽 碳酸鹽,一些物質(zhì)在培養(yǎng)基中的應(yīng)用原理,5.具有PH指示作用的 中性紅指示液 變色范圍 pH6.88.0（紅黃） 孔雀綠指示液 變色范圍 pH0.02.0（黃綠）；11.013.5(綠無色) 石蕊指示液 變色范圍 pH4.58.0（紅藍(lán)） 甲基紅指示液 變色范圍 pH4.26.3（紅黃） 剛果紅指示液 變色范圍 pH3.05.0（藍(lán)紅） 亮綠指示液 變色范圍 pH0.02.6（黃綠） 結(jié)晶紫指示液 pH值0.15（黃）0.32（綠），pH值1.0（綠）1.5（藍(lán)），pH值2.0（藍(lán)）3.0（紫）。 溴甲酚紫指示液變色范圍 p

4、H5.26.8（黃紫） 溴麝香草酚藍(lán)指示液 變色范圍 pH6.07.6（黃藍(lán)）,一些物質(zhì)在培養(yǎng)基中的應(yīng)用原理,6.其它 硫酸亞鐵 色氨酸 脲酶,培養(yǎng)特性,（一）體外培養(yǎng)的要求 營養(yǎng)、溫度、PH、氣體、培養(yǎng)時間 （二）培養(yǎng)性狀 1.液體培養(yǎng)基 需氧菌：菌膜 兼性厭氧菌：均勻渾濁 厭氧菌：沉淀 2.固體培養(yǎng)基 菌落特點(diǎn):大小、顏色、邊緣、濕潤程度 3.色素 脂溶性：菌體有顏色（如金黃色葡萄球菌） 水溶性：菌體和培養(yǎng)基都有顏色（如綠膿桿菌）,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的

5、滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,同一種培養(yǎng)基的配方在不同文獻(xiàn)中常存在某些差別。 因此應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄:包括名稱、配方及其來源、pH值、消毒的溫度和時間、制備的日期和制備者等，以防發(fā)生混亂。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的

6、調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,必須精確稱取，并注意防止錯亂。 可將配方置于傍側(cè)，每稱好一種成分即在配方上做出記號,最后還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,可先用溫水加熱并隨時攪動、以防焦化。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，直至煮沸。 在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的

7、制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,經(jīng)加熱煮沸，培養(yǎng)基各成分完全溶解, 待冷卻接近室溫時,應(yīng)進(jìn)行pH的調(diào)正。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,培養(yǎng)基必須均質(zhì)透明。 通常采用過濾以達(dá)到此項要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和

8、溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于適當(dāng)容器內(nèi)。 分裝量一般超過容器裝盛量的2/3。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,一般采用高壓蒸汽滅菌方法（121，15min）。 某些畏熱成分，如糖類、血清等，一般以過濾方法除菌，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基

9、各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,滅菌以后，應(yīng)仔細(xì)檢查，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常等、均應(yīng)挑出棄去。 將全部培養(yǎng)基放入37 恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，即棄去。 用已知菌株接種部分培養(yǎng)基,培養(yǎng)2448h。如無菌生長或生長不良，應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去。,4、培養(yǎng)基制備的基本方法,培養(yǎng)基配方的選定 培養(yǎng)基的制備記錄 培養(yǎng)基成分的稱取 培養(yǎng)基各成份的混合和溶化 培養(yǎng)基pH的調(diào)正 培養(yǎng)基的過濾 培養(yǎng)基的分裝 培養(yǎng)基的滅菌 培養(yǎng)基的質(zhì)量測試 培養(yǎng)基的保存,應(yīng)存放于冷暗處，最好放于

10、普通冰箱內(nèi)； 平板培養(yǎng)基不宜超過3天； 必須附有明顯標(biāo)簽。,三、實(shí)驗材料,量杯（1000mL和500mL各1個）、玻璃棒、漏斗、三角瓶、試管、玻璃瓶（500mL）等； pH試紙、紗布、脫脂棉、濾紙、包裝紙、扎線等； 牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂、葡萄糖、牛肉渣、蠟塊、蒸餾水、l mo1/L NaOH溶液和1 mo1/L HCl溶液等。,四、實(shí)驗內(nèi)容,普通肉湯的制備：,（1）常用配方:,牛肉浸膏 3-5g 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 磷酸氫二鉀 0.5g 蒸餾水1000mL,四、實(shí)驗內(nèi)容,普通肉湯的制備：,（2）配制方法:,取水600700mL，加熱； 按照配方稱取各物品加入水中，

11、邊加熱邊攪拌，快沸時注意不要溢出，沸騰后停止加熱；冷卻至室溫； 用pH試紙測定pH并調(diào)至7.2-7.6。 若pH7.6，則用0.1mo1/L HCl調(diào)低; 若pH7.2，則用0.1mol/L NaOH調(diào)高. 調(diào)好pH值后，補(bǔ)足水量至1000mL，再測pH值。,四、實(shí)驗內(nèi)容,厭氧肉湯的制備：,配制方法:,取制備好的普通肉湯5mL，裝于試管中，加入牛肉渣、蠟塊少許即可。,四、實(shí)驗內(nèi)容,普通瓊脂的制備：,普通肉湯 1000mL 瓊脂 20g,取普通肉湯 400mL于500mL瓶中; 加入優(yōu)質(zhì)瓊脂8g; 蓋好瓶塞，并用紗布扎口。,配方:,配制方法:,瓊脂的凝膠化溫度一般在3540,而凝膠熔點(diǎn)應(yīng)在758

12、5,常見凝固劑有瓊脂、明膠、無機(jī)硅膠等,四、實(shí)驗內(nèi)容,高壓滅菌,將所有要高壓的物品整齊的擺放在高壓滅菌鍋內(nèi)； 蓋好壓力蓋，關(guān)閉放氣孔，接通電源； 壓力達(dá)到0.05MPa時，關(guān)閉電源緩慢放氣至壓力為0，接通電源；再重復(fù)放氣1次； 維持121, 15-20min,操作方法:,六、思考題,制備細(xì)菌培養(yǎng)基的要求？ 制備培養(yǎng)基制作的一般步驟？ 在你制作的培養(yǎng)基中接種細(xì)菌，細(xì)菌不能生長，分析其原因。,演示內(nèi)容,血培養(yǎng)基制備?？鼓獰o菌的采集； 澆注平板。要領(lǐng)：疊澆、鋪滿但要?。?斜面的制作：高度1/5，斜面1/2； 半固體：1/3（0.3-0.5%） 液體：1/4 TSI:底層厚 厭氧培養(yǎng)基的制備及原理。,1.取水500mL，加熱； 2.按照配方稱取各物品加入水中，邊加熱邊攪拌，快沸時注意不要溢出，沸騰后停止加熱；冷卻至室溫； 牛肉浸膏 3.75g 蛋白胨 7.5g 氯化鈉 3.75g 磷酸氫二鉀 0.375g 補(bǔ)足水量至750mL 3. 用pH試紙測定pH并調(diào)至7