1、病理常規(guī)組織處理,1,組織標(biāo)本離體后，要經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟和包埋等一系列的后續(xù)處理。組織處理的每一個步驟都非常重要。 因為標(biāo)本的取材，部位的選擇等等，都或多或少地會影響到組織處理的程序、染色的效果以及最終的診斷是否合適 組織結(jié)構(gòu)的保存、有效成分的保留，取決于組織處理所使用的試劑和各步驟處理的時間等因素。為病理診斷提供優(yōu)質(zhì)的切片需要技術(shù)人員在日常的工作中不斷積累熟練的技巧和經(jīng)驗。,2,一.固定,病理標(biāo)本的制作和組織處理都必須先進(jìn)行固定。如果固定不佳，制片的其它程序?qū)⒎浅＠щy，可以說沒有很好的固定就沒有很好的HE染色，就會造成診斷困難，甚至誤診，這足以證明固定的重要性,3,概念：組織離體后

2、，采用某些辦法使其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)盡可能接近其生活狀態(tài)時的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。（應(yīng)用各種方法使病理標(biāo)本盡量保持其離體前狀態(tài)的過程） 目的：防止組織細(xì)胞自溶和腐敗，保持細(xì)胞內(nèi)成分（蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物或酶類）與原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。,4,方法：,1.物理學(xué)方法：如低溫冷凍，干冰 （dryice，即固態(tài)無水碳酸）冰凍真空脫水，石蠟滲入法。 2.化學(xué)方法：采用各種化學(xué)溶液作固定液，使組織細(xì)胞進(jìn)入固定狀態(tài)。這是國內(nèi)最常用的方法。,5,注意：,1.組織離體及時固定（大標(biāo)本切開固定） 2.組織塊大小適宜（1.51. 50.2厘米為宜） 3.合理選擇固定液（免疫組化可以選擇多聚甲醛和中性緩沖甲醛；我病理科

3、大標(biāo)本一般選擇中性緩沖甲醛，它可以兼顧常規(guī)染色和免疫組化。小標(biāo)本選用AAF液） 4.固定液的量為組織5倍以上（最少也要沒過組織） 5.固定時間得當(dāng)：大標(biāo)本（6-12H）小標(biāo)本（3-6H），時間太短，影響組織固定的效果，對以后一系列的處理都有影響，切片質(zhì)量難以保證。組織長時間的固定，福爾馬林會產(chǎn)生一種酸，影響核的染色。另外，長時間的固定往往會出現(xiàn)福爾馬林色素，尤其是造血器官的標(biāo)本，更應(yīng)注意。固定時間過長，可降低抗原的活性，影響組化。,6,微小破碎組織，在包埋操作時易于識別操 作，組織處理前可浸泡在1%伊紅液中5-10分鐘。伊紅的粉紅色在組織處理時可以保留，但是在隨后的切片染色中可以洗去不影響正常

4、的染色。,7,常用固定液的介紹和配制,1.10中性緩沖福爾馬林 ： 甲醛100ml，無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）13g磷酸二氫鈉（NaH2PO4H2O）4.0g， 蒸餾水900ml 特點：滲透力強(qiáng)，收縮小，對抗原保存較好，此液固定效果比單純10福爾馬林要好。,8,2.AAF液：95乙醇85ml，甲醛（濃）10ml，冰醋酸5ml。 特點：此液除有固定作用外，兼有脫水作用，因此，固定后可直接入95乙醇脫水。 其他還有很多固定液，不一一介紹，有些液體混合后使用比單獨使用效果更佳，作用互補(bǔ)，真正達(dá)到固定的目的。,9,二.水洗,1.固定后必須水洗（15-30min),流水沖洗最佳，特別是固定時間長的

5、組織。 2.水洗不徹底后果：福爾馬林色素沉著、脫片、染色不鮮艷、免疫組化標(biāo)記中抗原抗體結(jié)合力減弱等現(xiàn)象,10,三.脫水,概念：利用脫水劑將組織內(nèi)的水分置換出來，以利于有機(jī)溶劑的滲入。 濃度與時間：脫水用的乙醇濃度一般從7075開始，然后依次8095100，即由低濃度逐步到高濃度。脫水的時間與組織大小、厚薄有很大關(guān)系、組織厚大，脫水時間要長些；而小薄的組織脫水時間相對的可以短些。組織脫水時間在低濃度乙醇中可以長些（如7080），而在高濃度乙醇中要短些，這是因為高濃度的乙醇滲透力不強(qiáng)，延長脫水時間無益，相反高濃度乙醇易使組織收縮、變脆，致使以后切片和觀察困難。,11,脫水劑的種類有很多種，如乙醇、

6、丙酮、甲醇、異丙基醇等。 丙酮是透明無色易燃液體，易與水、乙醇和大多數(shù)有機(jī)溶液相混合。其脫水快，但滲透差，脫水時間長易引起組織扭曲和變形。丙酮用于脫水可以去除組織中的脂肪。另外，堅硬的組織也可以置入甘油乙醇混合液中浸泡處理。,12,組織脫水不足的補(bǔ)救,組織脫水不足常影響后繼的透明與浸蠟, 表現(xiàn)為含蠟組織塊發(fā)軟，制成蠟塊后組織塊與周邊石蠟容易發(fā)生脫離，此種蠟塊往往難以切出組織薄片或即使強(qiáng)行切出也會出現(xiàn)組織擠壓、破碎，影響病理診斷。,13,圖1組織脫水不足所制蠟塊, 切片鏡下觀察, 組織擠壓、破碎, 核染色不清 圖2 補(bǔ)救處理后, 組織平整、無破碎, 核染色清晰,14,把蠟塊放入60度石蠟溶液中,

7、使組織周圍石蠟完全溶解, (1)保持組織塊內(nèi)石蠟成份處于溶融狀態(tài)。同時,在75度水浴槽內(nèi)先后放入盛有30 ml丙酮的A、B 兩組燒杯(50 ml容積),時間差約為5 min,預(yù)熱丙酮。(2)待A丙酮完全沸時, 放入組織塊, 此時丙酮內(nèi)逐漸有白色糊狀石蠟沉淀出現(xiàn), 組織塊有液泡冒出。(3)當(dāng)B丙酮完全沸時, 迅速將組織塊從A丙酮換入其中, 處理10 min,此時丙酮內(nèi)石蠟沉淀明顯減少, 組織塊僅有少量或無液泡冒出。(4)取出組織塊, 立即投入75度石蠟溶液中, 直至組織塊無氣泡冒出, 約15 min。(5)常規(guī)包埋、切片、HE 染色。,15,原理：,本法以沸丙酮為介質(zhì)。其原理為: (1) 丙酮和

8、石蠟不相溶，此特性保證了彼此單向置換，即以丙酮為溶液時，石蠟被置出；以石蠟為溶液時，丙酮被置出。(2)以75度作為脫蠟與浸蠟的適宜溫度，遠(yuǎn)高于丙酮沸點(56-57)及石蠟溶點(58-60)，能使丙酮與石蠟有效而快速地進(jìn)行單向置換。(3)丙酮作為一種快速脫水劑，目前主要用于快速石蠟切片的制備 ，適宜溫度亦為75度。,16,四. 透明,概念：透明是組織經(jīng)脫水后，用能與脫水劑及石蠟混合的試劑，將脫水劑置換出來，使石蠟均勻滲透進(jìn)去，有的透明劑可使組織呈透明狀態(tài)，故稱得。 常用的透明劑為二甲苯，但它易使組織收縮、變脆，故透明時間不宜長 二甲苯還能溶解脂肪，因此我們看到切片中的脂肪細(xì)胞胞漿是空泡狀，是二甲

9、苯脫脂所致。,17,五. 浸蠟,概念：浸蠟是組織經(jīng)透明后，置入熔化的石蠟中浸滲，一般為2-4小時。浸蠟時間過短，蠟沒有完全滲入組織中，組織過軟，切片困難；浸蠟時間過長，造成組織硬脆，切片也困難） 目的：將石蠟均勻浸滲至組織中，使組織的硬度與石蠟的硬度相似，利于切片。浸蠟后的組織用包埋框?qū)⑵浒瘛０裼孟灥娜埸c要與最后一次浸的石蠟熔點相一致，這樣有利于切片。,18,浸蠟溫度應(yīng)與石蠟熔點想對應(yīng)，有條件的話（第一道石蠟可用48-50度熔點的石蠟），第二、三道石蠟用56-58度熔點的石蠟，溫箱溫度不宜高于62度。盡量不要在蠟里帶入二甲苯。 低熔點石蠟通常較柔軟，高熔點石蠟通常比較堅硬，耐受切片。,19

10、,六.包埋,包埋機(jī)一般由3個部分組成：自動流蠟器、冷臺以及儲備底座和組織包埋盒的熱槽。 石蠟經(jīng)過噴嘴自動流入大小合適的包埋底座。組織在包埋底座中排列方向和位置，加蓋塑料包埋盒，形成一個帶有組織的平行的蠟塊。,20,注意：,當(dāng)組織包埋時，組織的方向?qū)ψC明或顯示組織的形態(tài)是一個重要的問題。組織的定向或定位不應(yīng)該對組織切片有影響。錯誤的定向可能會導(dǎo)致所需組織成分的破壞或錯誤的診斷。大部分組織是平埋的，組織周邊的包埋介質(zhì)將對組織起到固定保護(hù)作用。 以下組織需要特殊定向包埋：腔性結(jié)構(gòu)如動脈、靜脈、脈管需橫切；皮膚、腸道、膽囊、膀胱和其它上皮類活檢組織，應(yīng)從底下開始切片，保證組織的上皮面最后切到，這樣可以

11、減少對上皮的擠壓，損傷切片；肌肉活檢：橫向和長縱向切片；多塊碎組織應(yīng)一個接一個排列，保證組織結(jié)構(gòu)在包埋時排列方向上的一致。,21,過夜標(biāo)本處理實施,對許多科室來說，過夜處理是相對常用的一種處理模式。組織固定浸泡于10%福爾馬林或AF液，梯度乙醇、二甲苯或二甲苯的替代物，以及石蠟浸透。使用自動組織處理機(jī)制定程序時應(yīng)考慮影響處理程序的以下諸多因素：即實驗室所需要的結(jié)束時間；使用的液體是否需要加熱；是否啟用加壓，真空功能；組織標(biāo)本數(shù)量的多少及體積的大小等,22,1.固定4-6H 2.水洗20-30min 3.75%乙醇2h 4.85%乙醇2h 5.95%乙醇 6.100%乙醇 7.100%乙醇1.5

12、h 8.二甲苯30min 9.二甲苯30min 10.浸蠟30min 11.浸蠟1.5h 12.浸蠟1.5h,23,組織干燥處理：,組織處理的機(jī)器或設(shè)備發(fā)生故障時，導(dǎo)致組織在浸蠟之前發(fā)生干燥（干涸），組織可能會失去正常的形態(tài)，以下糾正處理的方法有助于幫助組織得到可以滿足診斷需要的切片。組織干燥的修復(fù)方法：70%乙醇70ml，甘油30ml，二硫水楊酸鈉1g，組織在該溶液停留數(shù)小時或過夜。組織處理重新從脫水液開始直至完成。組織切片時可能有些困難，為防止組織脫片可使用涂膠載玻片。,24,常見問題及處理方法討論：,1.跳刀有波浪樣或搓衣板樣改變： 出現(xiàn)跳刀有波浪樣或搓衣板樣改變的現(xiàn)象一般都是由于組織太

13、硬或切片刀不夠鋒利造成的; 也可能是由于切片機(jī)的零件松動造成的。因此, 切片前要把切片機(jī)的有關(guān)螺旋擰緊, 沒有擰緊或包埋的蠟塊過硬時就會出現(xiàn)跳刀, 形成波浪樣或搓衣板樣改變的現(xiàn)象。同時, 調(diào)整刀鋒與蠟塊的適宜角度, 也可以防止跳刀的現(xiàn)象出現(xiàn),25,2.切片不全或有刮劃痕跡：,修片時深度不夠、組織沒有全部暴露于切面; 切片的刮劃痕跡是由于切片刀有缺口或者是包埋的組織有異物（線結(jié)）、鈣化組織、骨組織及包埋石蠟有沙粒造成的。因此, 修片時保證組織塊全部暴露于切面; 保證切片刀的鋒利沒刀口; 同時在組織取材時去除手術(shù)異物和鈣化組織; 骨組織要完全脫鈣。這樣可以保證切片的完整和平整美觀,26,3.組織龜

14、裂或有異物：,組織龜裂是由于烤片時溫度過高, 切片急速受熱切片過度伸張引起的; 由于展片用的水有異物而污染切片。因此, 攤片池的水要勤換, 防止異物污染; 同時, 切片在空氣中略干燥后烤片, 烤箱溫度為65度為宜, 烤片時間15-30min為宜。對于腦組織切片必須待切片完全晾干后才能烤片。（本科室因為蠟塊數(shù)多，時間緊，故有不規(guī)范的地方）,27,4.脫蠟不干凈, 可見片狀或點狀發(fā)白,石蠟切片必須經(jīng)過脫蠟才能染色, 脫蠟的好壞取決切片的溫度和二甲苯的溫度, 烤片時必須將切片放置溫箱加熱到切片的石蠟融化后立即入二甲苯中脫蠟, 或者將二甲苯稍加熱脫蠟, 這樣可以脫蠟更加完全, 更加徹底, 然后經(jīng)過梯度的泡洗, 把二甲苯洗干凈才能染色, 否則, 由于切片中石蠟或二甲苯的殘留, 染色劑與細(xì)胞不能有效接觸而不著色, 導(dǎo)致切片出現(xiàn)片狀或點狀發(fā)白,28,5.切片過厚, 細(xì)胞核模糊不清;,由于切片刀不夠鋒利或者組織脫水不理想、組織塊冰凍不夠以及切片機(jī)準(zhǔn)確度不高都會導(dǎo)致組織切片過厚, 切片經(jīng)染色后細(xì)胞重疊, 細(xì)胞核模糊不清, 影響鏡下觀察, 容易造成誤診或漏診,