1、,生物技術(shù)實(shí)踐,第 37 講,DNA和蛋白質(zhì)技術(shù),選修1,1進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定。 2嘗試PCR技術(shù)的基本操作和應(yīng)用。 3嘗試蛋白質(zhì)的提取和分離。,1(2010江蘇)某生物興趣小組開(kāi)展DNA粗提取的相關(guān)探究活動(dòng)。具體步驟如下： 材料處理：稱取新鮮的花菜、辣椒和蒜黃各2份，每份10 g。剪碎后分成兩組，一組置于20 、另一組置于20 條件下保存24 h。 DNA粗提?。?第一步：將上述材料分別放入研缽中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用兩層紗布過(guò)濾，取濾液備用。,第二步：先向6只小燒杯中分別注入10 mL濾液，再加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒緩緩地向一個(gè)方向攪拌

2、，使絮狀物纏繞在玻璃棒上。 第三步：取6支試管，分別加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮狀物。 DNA檢測(cè)：在上述試管中各加入4 mL二苯胺試劑，混合均勻后，置于沸水中加熱5 min，待試管冷卻后比較溶液的顏色深淺，結(jié)果如下表。,(注：“”越多表示藍(lán)色越深) 分析上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，回答下列問(wèn)題： (1)該探究性實(shí)驗(yàn)課題名稱是 。 (2)第二步中“緩緩地”攪拌，這是為了減少 。,探究不同材料和不同保存溫度對(duì)DNA提取量的影響,DNA斷裂,(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出結(jié)論并分析。 結(jié)論1：與20 相比，相同實(shí)驗(yàn)材料在20 條件下保存，DNA的提取量較多。 結(jié)論2： 。 針對(duì)結(jié)論1，請(qǐng)?zhí)岢龊侠淼?/p>

3、解釋： 。 (4)氯仿密度大于水，能使蛋白質(zhì)變性沉淀，與水和DNA均不相溶，且對(duì)DNA影響極小。為了進(jìn)一步提高DNA純度，依據(jù)氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基礎(chǔ)上繼續(xù)操作的步驟是： ，然后用體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液使DNA析出。,等質(zhì)量的不同實(shí)驗(yàn)材料，在相同的保存溫度下，從蒜黃提取的DNA量最多,低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解速度慢,將第三步獲得的溶液分別與等量的氯仿充分混合，靜置一段時(shí)間，吸取上清液,本題考查了DNA粗提取技術(shù)的原理、操作過(guò)程及學(xué)生的分析、判斷能力。從題目實(shí)驗(yàn)看出，該實(shí)驗(yàn)的課題名稱是探究不同材料和不同保存溫度對(duì)DNA提取量的影響。在實(shí)驗(yàn)的第二步中，為了防止DNA斷

4、裂，要緩緩地?cái)嚢?。從表中結(jié)果看出，由于低溫抑制了相關(guān)酶的活性，DNA降解慢，使得相同材料在低溫保存時(shí)，DNA提取量大；在相同保存條件下，蒜黃藍(lán)色最深，說(shuō)明相同條件下從蒜黃中提取的DNA量最大。由于氯仿密度比水大，可使蛋白質(zhì)變性后沉淀，而與水、DNA不相溶，這樣可將第三步獲得的溶液分別與等量的氯仿混合，靜置一段時(shí)間，吸取上清液即可得到較純凈的DNA。,2.(2008山東)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)家蠅體內(nèi)存在一種抗菌活性蛋白。這種蛋白質(zhì)具有極強(qiáng)的抗菌能力，受到研究者重視。 (1)分離該抗菌蛋白可用電泳法，其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子的，大小及性狀不同，在電場(chǎng)中的不同而實(shí)現(xiàn)分離。,電荷(帶電情況),遷移速度,(2)可用

5、金黃色葡萄球菌來(lái)檢驗(yàn)該蛋白質(zhì)的體外抗菌特性。抗菌實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基中的牛肉膏和蛋白胨主要為細(xì)菌生長(zhǎng)提供和。 (3)分別在加入和未加入該抗菌蛋白的培養(yǎng)基中接種等量菌液。培養(yǎng)一定時(shí)間后，比較兩種培養(yǎng)基中菌落的，確定該蛋白質(zhì)的抗菌效果。 (4)抗菌培養(yǎng)常用的接種方法有 . 和。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)使用過(guò)的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行處理。,碳源,氮源,數(shù)量,平板劃線法,稀釋涂布平板法(稀釋混合平板法),滅菌,(1)電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如多肽、蛋白質(zhì)、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。

6、電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。,(2)牛肉膏和蛋白胨是成分復(fù)雜的天然有機(jī)物，能為微生物提供碳源、氮源。 (3)可采用逆向思維。若抗菌蛋白具有抗菌效果，即抗菌蛋白抑制了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖，則不形成菌落或菌落數(shù)量明顯偏少。,(4)微生物接種的方法很多，最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。平板劃線法通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋。然后將不同稀釋度的菌液分別涂

7、布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用過(guò)的培養(yǎng)基應(yīng)該進(jìn)行滅菌處理才能倒掉，這樣做的目的是防止造成環(huán)境污染。,一、DNA的粗提取與鑒定 1.原理,二苯胺,低,2.粗提取流程(以雞血細(xì)胞液做實(shí)驗(yàn)材料為例),3.鑒定,本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞內(nèi)無(wú)細(xì)胞核，但它可作為血紅蛋白提取和制備細(xì)胞膜的理想材料。,二、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 1.生物體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR反應(yīng)的比較,2.PCR反應(yīng),蛋白質(zhì)分離的方法,三、血紅蛋白的提取和分離 1.蛋白質(zhì)分離的方法,凝膠色譜法,電泳法,凝膠色譜法,較快,較慢,原理:一些生物大分子(如多肽、核酸等),

8、在一定pH下，其可解離的基團(tuán)會(huì)帶 上正電或負(fù)電,在電場(chǎng)的作用下,這些 帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷的 電極移動(dòng) 影響因素:各種分子帶電性質(zhì)的差異以及 分子本身的大小、形狀 常用方法:瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺 凝膠電泳(通常使用聚丙 烯酰胺凝膠電泳),電泳法,相反,SDS,2.蛋白質(zhì)的提取和分離操作流程,生理鹽水,相對(duì)分子,質(zhì)量的大小,相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量較小的容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)只能在凝膠外部移動(dòng)，移動(dòng)速度快，因此相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子彼此分離。,1.如何正確區(qū)分破碎動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的原理和方法？,2.教材中去除濾液中雜質(zhì)的三種

9、方案有什么不同？,3.如何區(qū)分DNA粗提取實(shí)驗(yàn)中部分操作的目的？,4.什么是3端和5端？DNA復(fù)制為什么需要引物？ 為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(OH)末端稱為3端，而含磷酸基團(tuán)的末端稱為5端；一個(gè)雙鏈DNA分子中含2個(gè)3端和2個(gè)5端，如果一條鏈的方向是35，則另一條鏈的方向就是53，這就是反向平行的含意。 DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3端延伸DNA鏈。PCR實(shí)驗(yàn)中，引物長(zhǎng)度通常為2030個(gè)核苷酸。,5.PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意哪些問(wèn)題？如何進(jìn)行PCR結(jié)果的分析與評(píng)價(jià)？ (1)PCR實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)： 避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前進(jìn)行高壓滅菌

10、。 緩沖液和酶分裝成小份，-20 低溫保存。 每添加一種反應(yīng)成分，更換一個(gè)移液器的槍頭。 混勻后離心處理，使反應(yīng)液集中在離心管底部。,(2)PCR結(jié)果的分析與評(píng)價(jià)： 對(duì)于教材中的方法，可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。 原理：DNA在260 nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。 過(guò)程：稀釋對(duì)照調(diào)零測(cè)定計(jì)算。 對(duì)于電泳檢測(cè)的方法，可以通過(guò)在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果。 擴(kuò)增不成功的可能原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?6.分離血紅蛋白的樣品處理中，紅細(xì)胞洗滌時(shí)為什么要低速短時(shí)間離心，并且要

11、洗滌三次？ 紅細(xì)胞洗滌時(shí)，洗滌次數(shù)、離心速度與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞等一起沉淀，達(dá)不到分離的效果。洗滌三次后，若上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)，否則無(wú)法除去血漿蛋白。,7.凝膠色譜柱的裝填有什么要求？如何進(jìn)行樣品的加入和洗脫？ 在色譜柱中填凝膠的時(shí)候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。一是在裝填凝膠柱時(shí)，不能有氣泡存在，因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。二是在凝膠色譜操作過(guò)程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生上述兩種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。,滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，不要破

12、壞凝膠面。在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過(guò)程中的移動(dòng)情況，如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。根據(jù)紅色區(qū)帶的移動(dòng)狀況判斷收集流出液時(shí)間，待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL 收集一管，連續(xù)收集。,DNA的粗提取與鑒定 下表是關(guān)于DNA粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，所使用的材料、操作及其作用的表述，正確的是(),C,在“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中檸檬酸鈉可以防止血液凝固；雞血中加入蒸餾水可以使細(xì)胞膜破裂；DNA在不同的氯化鈉溶液中的溶解度不同，在0.14 mol/L 時(shí)，溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，但細(xì)胞中的某些物質(zhì)可以溶于酒精，所以加入

13、酒精，可以獲得較純的DNA；DNA遇二苯胺產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)(需要沸水浴加熱)。,在“DNA粗提取與鑒定”的實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2 mL 的四種溶液中，經(jīng)攪拌后過(guò)濾，獲得4種濾液，含DNA較少的是() A.B. C.D.,C,DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L 的NaCl溶液中溶解度最低，參照DNA在NaCl溶液中溶解度曲線，可知中只有濾液G中DNA含量較少。DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精，利用這一原理可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離，可見(jiàn)濾液H中DNA也較少。,DNA與蛋白質(zhì)的溶解性不同：,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片

14、段 關(guān)于DNA的復(fù)制，下列敘述正確的是() A.DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從5端延伸DNA鏈 B.DNA復(fù)制不需要引物 C.引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行結(jié)合 D.DNA的合成方向總是從子鏈的3端向5端延伸,C,由于DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從引物的3端即復(fù)制方向由3端向5端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈?zhǔn)且罁?jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5端向3端延伸。,下圖示PCR技術(shù)擴(kuò)增獲取DNA的過(guò)程。擴(kuò)增時(shí)首先使DNA兩條鏈解開(kāi)為單鏈；然后冷卻使“引物”(DNA復(fù)制時(shí)所需的約20個(gè)核苷酸的短鏈)與單鏈相應(yīng)堿基互補(bǔ)序列結(jié)合；再

15、在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下進(jìn)行延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈，如此反復(fù)循環(huán)。上述過(guò)程可在PCR擴(kuò)增儀中自動(dòng)完成。,(1)圖中過(guò)程也稱為DNA的變性，此過(guò)程在溫度高達(dá)9095 時(shí)才能完成，說(shuō)明DNA分子具有性。 (2)過(guò)程在人體內(nèi)可由. 催化完成。 (3)由題中信息可知，在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行DNA自動(dòng)擴(kuò)增時(shí)，若起始時(shí)有a個(gè)DNA分子，連續(xù)擴(kuò)增n代，可形成個(gè)DNA分子。,穩(wěn)定,DNA聚合酶(DNA,a2n,聚合酶、DNA連接酶),DNA比蛋白質(zhì)更能忍受高溫，分子結(jié)構(gòu)具有相對(duì)的穩(wěn)定性，其中GC堿基對(duì)占比例越高的DNA分子越穩(wěn)定。為延伸過(guò)程，在體外擴(kuò)增是耐高溫的DNA聚合酶催化，在體內(nèi)是由DNA聚

16、合酶催化完成。依據(jù)起始a個(gè)以及DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)，可得答案。 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性、延伸三步。兩引物之間的固定長(zhǎng)度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增。,血紅蛋白的提取和分離 蛋白質(zhì)的分離與純化技術(shù)是蛋白質(zhì)研究的重要技術(shù)。下列有關(guān)敘述不正確的是() A.根據(jù)蛋白質(zhì)分子不能透過(guò)半透膜的特性，可將樣品中各種不同的蛋白質(zhì)分離 B.根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)的差異及分子大小等，可通過(guò)電泳分離蛋白質(zhì) C.根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，可通過(guò)凝膠色譜法分離蛋白質(zhì) D.根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、密度不同，可通過(guò)離心沉降法分離蛋白質(zhì),A,A項(xiàng)蛋白質(zhì)分子既然不能透過(guò)半透膜，那樣品中的各種不同的蛋白質(zhì)仍在透析袋內(nèi)，而不能達(dá)到分離的目的。B正確：電泳利用了分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。C正確：凝膠色譜法也稱作分配色譜法，是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。D