1、page 1,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),蔡司光學(xué)儀器,page 2,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,什么是顯微鏡熒光檢測？,一般熒光顯微鏡熒光觀察，是借標本: 1）本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)吸收熒光光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)的熒光現(xiàn)象，或 2）利用組織及細胞內(nèi)某成分可與熒光染料（熒光色素）結(jié)合并受到熒光激發(fā)后所出現(xiàn)特定顏色的熒光供作觀察。作出定性、定位（根據(jù)熒光圖象的形態(tài)學(xué)特征和顏色）和定量（根據(jù)熒光的亮度）。 其中：1）為自發(fā)熒光，2）為繼發(fā)熒光。,page 3,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,落射

2、熒光與透射光觀察的區(qū)別,page 4,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,落射熒光與透射光觀察的區(qū)別,什么是熒光 ?,物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。 顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光,page 6,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,熒光的性質(zhì),吸收光，必需有激發(fā)光源 熒光波長激發(fā)波長（損失熱能） 熒光強度極小于激發(fā)光的強度 有不同程度的衰減 熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率,page 7,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,

3、熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途,優(yōu)點： 檢出能力高（放大作用） 對細胞的刺激?。梢曰铙w染色） 能進行多重染色 用途： 物體構(gòu)造的觀察熒光素 熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別抗體熒光等 發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析,page 8,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,標本制作的順序,組織固定、取材、組織脫水、包埋、切片、染色、封片 培養(yǎng)的懸浮細胞、粘附細胞,page 9,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,組織固定,活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織學(xué)改變，并導(dǎo)致形態(tài)學(xué)上可見的細胞器變化和細胞組織的形態(tài)改變直至腐敗自溶

4、。 選擇最佳固定液標準是： （1）最好地保持細胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)； （2）最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金屬的固定液在免疫組化和細胞化學(xué)技術(shù)中是禁用的； （3）不要用可能帶有自發(fā)熒光的固定劑，如帶有苦味酸的固定劑，還有甲醛升汞固定液，會使上皮細胞產(chǎn)生非特異性熒光； （4）固定劑的選擇、固定時間、溫度和ph值都會影響實驗結(jié)果。,page 10,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,單純固定液,（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能滿足常規(guī)he及免疫組化、pcr等工作。中性甲醛是以ph7.2-7.4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)于一般的4

5、%甲醛固定液。此固定液配制后應(yīng)密封并保存在陰涼處，保存時間不超過一個月。 甲醛（40%） 100ml 無水磷酸氫二鈉 6.5g 磷酸二氫鈉 4.0g 蒸餾水 900ml,page 11,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,單純固定劑,（2）乙醇固定液：使用時以80%-95%的濃度為宜，具有硬化、固定、脫水等作用，對組織滲透力較弱，因此很少單獨使用，但其保存組織中的核酸強于中性甲醛，故常用于有核酸操作的實驗或檢查，如果用于證明尿酸結(jié)晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定組織。 （3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培養(yǎng)細胞的固定。,page 12,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28

6、.07.2020,混合固定液,（1）乙醇-甲醛（乙醇-福爾馬林，af）固定液：適用于皮下組織中肥大細胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定后的標本可直接入95%乙醇脫水。 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml （2）b5（醋酸鈉-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應(yīng)進行脫汞沉淀處理。 無水醋酸鈉 1.25g 升汞 6.0g 蒸餾水 90ml 使用前加入甲醛 10ml,page 13,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,混合固定液,（3）bouin固定液：特別適用于睪丸活檢組織的固定。bouin液對組織固定較均勻，收縮很少，不會使組織變硬變脆。需現(xiàn)配

7、現(xiàn)用。 飽和苦味酸水溶液（約1.22%） 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml （4）carnoy固定液：穿透能力強，可很好的固定細胞質(zhì)和細胞核，特別適用于固定外膜致密的組織，也適用于糖原及尼氏小體的固定。 無水乙醇 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml,page 14,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,混合固定液,（5） zenker固定液：經(jīng)此液固定的標本，細胞核和細胞質(zhì)染色頗為清晰，但成本較高且需特殊處理汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引起化學(xué)變化而失效。 升汞 5.0g 重鉻酸鉀 2.5g 硫酸鈉 1.0g 蒸餾水（加至）100ml,page 15,熒光細

8、胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,取材,組織取材：按病理診斷和研究的目的和要求，從標本上切取適當大小和數(shù)目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診斷以及相關(guān)研究。 細胞標本的取材 （1）貼壁生長的培養(yǎng)細胞 （2）懸浮的培養(yǎng)細胞： 沉淀涂片，細胞離心涂片器（cytospin）， 載玻片上涂粘附劑多聚賴氨酸（0.010.5%）， 甲醛-明膠，鉻礬明膠， vectabond試劑 （3）體液沉淀涂片法 （4）穿刺吸取涂片法 （5）印片法,page 16,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,組織脫水,page 17,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,包

9、埋,組織塊經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟等處理后，用包埋劑（如石蠟、樹脂、塑料等）將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。 包埋步驟 先將熔化的石蠟注入包埋托內(nèi)，而后用鑷子將經(jīng)過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺商，用鑷子輕按組織塊，以達到組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟，移至冷凍臺上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時應(yīng)根據(jù)組織的不同，選擇大小型號合適的包埋托；有要求直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停片刻，以使組織組織在蠟?zāi)龝r立住，達到立埋的要求。,page 18,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,切片,冰凍切片 為免疫組織化學(xué)

10、染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點是能夠比較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應(yīng)該采用冰凍切片。新鮮的組織及已經(jīng)固定的組織均可作冰凍切片。 冰凍切片后如果不染色，必須吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預(yù)固定后貯存于冰箱中保存。 要注意刀片等接觸陽性物質(zhì)的污染問題。,page 19,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,切片,石蠟切片 其優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能連續(xù)切片（薄片），組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準確。 用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同，主要是要在比較低的溫度下進行。 脫水、透明等過程應(yīng)在4下

11、進行，以盡量減少組織抗原的損失； 組織塊大小應(yīng)限于2cm x 1.5cm x 0.2cm，使組織充分脫水、透明、浸臘； 浸臘、包埋過程中，石蠟應(yīng)該保持在60以下，以熔點低的軟臘最好（低溫石蠟包埋）； 石蠟切片應(yīng)放在37恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4冰箱內(nèi)備用； 冷凍干燥包埋法：可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白質(zhì)變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。,page 20,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,切片,振動切片 可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成20100um的厚片，以漂浮法進行染色。組織不冰凍，無冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組

12、化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能比較好地保留組織細胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)和細胞膜抗原。,page 21,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,封片,封片劑 常用甘油和0.5mol/l ph9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液。 如需將染色后的樣品保存一段時間，可以用指甲油在蓋玻片周圍封閉。暗處保存。 一般無須脫水透明以及用樹膠封片。如果必須脫水透明，封片最好用dpx。 由于激光共聚焦顯微鏡觀察采集圖象很快，所以一般用pbs或生理鹽水也可以。,page 22,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,組織和細胞的自發(fā)性熒光檢測,1、動物組織一般呈現(xiàn)弱

13、淡蘭色熒光，其中彈性纖維的熒光較強； 2、紅細胞血紅蛋白中的卟啉呈紅色熒光，但在正常情況下，卟啉和鐵離子相結(jié)合，鐵離子有抑制熒光作用，所以紅細胞不發(fā)熒光。如在血液中加酸使鐵離子游離，或缺鐵性貧血，紅細胞可呈紅色熒光； 3、細胞內(nèi)的脂褐素呈棕黃色的自發(fā)熒光，例如心肌細胞核兩側(cè)的肌漿內(nèi)，隨著年齡的增長或在某些疾病的情況下，可見較大量的棕黃色脂褐素熒光顆粒； 4、某些腫瘤細胞在紫外或藍光激發(fā)可呈現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光，可作原位腫瘤的早期診斷； 5、維生素a呈綠色的自發(fā)性熒光。如大鼠食入維生素a后，在肝細胞、kuffer細胞、腎上腺束狀帶細胞、肺和腎的間質(zhì)細胞、卵巢間質(zhì)細胞和黃體細胞等的胞質(zhì)內(nèi)均可見到維生素

14、a的綠色熒光； 6、某些藥物也可呈現(xiàn)一定顏色熒光，如奎寧為綠色熒光，四環(huán)素為黃色熒光。四環(huán)素能與骨基質(zhì)中的鈣結(jié)合，利用這一特性，可以用四環(huán)素飼養(yǎng)動物以觀察新骨質(zhì)的形成。另外，四環(huán)素和癌細胞有較大的親合力，能在惡性腫瘤內(nèi)形成黃色的熒光灶； 7、有機體的單胺神經(jīng)原、消化道和呼吸道粘膜內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中的內(nèi)源性生物胺兒茶酚胺、5-羥色胺和組織胺等與某些醛類物質(zhì)在一定條件下可發(fā)生縮合反應(yīng)而呈現(xiàn)熒光。,page 23,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,熒光組織細胞染色（熒光探針檢測，熒光標記檢測）,page 24,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,熒光染色方法,浸

15、染（組織或細胞固定在玻片上浸入染色缸，懸浮細胞在懸液中染色，再涂于玻片上），適用于染液較多，樣品在玻片上固定比較牢固，染色時間需要比較長，染色均勻。 滴染（染色液直接滴在固定于玻片上的組織或細胞上），適用于染液較少，樣品在玻片上固定不是很牢固，染色時間較短。染色不易均勻，特別是時間比較長時，需添加染料。 漂浮法（組織片或培養(yǎng)黏附在一些膜上的組織細胞漂浮于染液上），適用于較大較厚的組織片，或黏附在一些膜上的組織細胞，染料使用相對較少。由于樣品一般是反過來面朝下（染液面），所以特別注意不要在樣品與染液間出現(xiàn)氣泡。,page 25,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,細胞骨架f-a

16、ctin（f-肌動蛋白）染色：,用fitc或rhodamine標記的phalloidin（鬼筆環(huán)肽）。 f-肌動蛋白是大多數(shù)真核細胞中以聚合絲形式存在的肌動蛋白。phalloidin能與細胞內(nèi)的f-actin特異性結(jié)合。激發(fā)光激發(fā)phalloidin上結(jié)合的熒光標記，使f-肌動蛋白被觀察到。 fitc或rhodamine標記的phalloidin，溶于甲醇中制成貯存液（200u/ml），染色時終濃度為5u/ml。 細胞涂片 pbs洗滌 2%戊二醛固定15分鐘 pbs洗滌 0.2%triton x-100抽提2分鐘 pbs洗滌 fitc或rhodamine標記的phalloidin室溫20分鐘

17、pbs洗滌，觀察。,page 26,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,fluorochromes and stains,dapi, hoechst, syto 16: semipermeant and permeant dna stain, apoptosis gfp: used in living systems as a gene/protein reporter lucifer yellow, fluorogold: neuronal tracer mitofluor green, mitotracker green: mitichondrial marker,pag

18、e 27,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,dii: lipophilic membrane marker rhodamine 6g, mitotracker red: mitochondrial and er marker propidium iodide, ethidium bromide, syto 25: impermeant and permeant nucleic acid stain,to-pro-3,alexa 488,alexa 568,human colon crypt christine anderson, laboratory of prof. ra

19、y white, hunstsman cancer institute, utah,page 29,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,細胞熒光離子探針,游離鈣離子含量測定： 有fura 2 am, indo 1和fluo 3am, 前兩者激發(fā)波長為紫外，而且均是雙激發(fā)波長的比率熒光，所以目前一般在熒光顯微鏡觀察，特別是激光共聚焦顯微鏡觀察中用fluo 3am。ex/em: 506/526。 fluo 3本身不發(fā)熒光，只有當與胞漿內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，受激發(fā)光照射才發(fā)出熒光。 fluo 3am不能與游離鈣離子結(jié)合，但它能穿過細胞膜進入細胞內(nèi)（fluo 3 不能透過細胞膜進入細胞

20、），進入細胞后的fluo 3am中的am被細胞內(nèi)非特異性酯酶水解，變?yōu)閒luo 3，fluo 3與細胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合，發(fā)出熒光。熒光強弱直接反應(yīng)了細胞內(nèi)鈣離子 的含量。 fluo 3am 染色：fluo 3am用dmso配成貯存液，冰凍保存，使用時終濃度為1um。染色一般為37，3045分鐘。 fluo 3染色細胞內(nèi)鈣離子，可以通過時間掃描，進行細胞內(nèi)鈣離子含量和分布的動態(tài)觀察。 細胞內(nèi)ph的測定： snafl：雙發(fā)射波長比率熒光。 ex: 514(488), em: 580/640 bcecf：雙激發(fā)波長比率熒光。 ex: 490/440, em: 530,page 30,熒光細胞化學(xué)樣品

21、制備和檢測技術(shù),28.07.2020,physiology probes,indo-1, fura-2: dual emission or dual excitation calcium probe calcium green, fluo-3: single wavelength calcium probe bcecf: single or dual excitation wavelength ph probe jc-1: potential sensitive mitochondrial dual emission calcein: volume changes, gap junctions

22、, liposomes, permeability lysosensor blue dnd-192, lysosensor green dnd-153: lysosomal marker nbd-c6 ceramide: golgi marker rhodamine-123: mitochondrial marker,page 31,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,snarf: ph indicator emission ratio fm1-43, rh-414: plasma membrane fura red: calcium indicator, decreased

23、 fluorescence on binding dic18(3), dic16(3): er marker lysotracker yellow dnd-68: lysosomal marker mitotracker orange, rhodamine b hexyl ester, tetramethylrosamine: mitochondrial marker,page 32,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,mouse; hippocampal neurons; fluorescence of gfp shigeo okabe department of anat

24、omy and cell biology tokyo medical and dental university,page 33,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù),根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。 熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。（較

25、常用） 熒光抗原法：用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。 免疫熒光細胞化學(xué)標記的熒光素以異硫氰酸熒光素（fitc綠色熒光）、羅丹明（tritc橙紅色熒光）、四甲基異硫氰酸羅丹明（tritc橙紅色熒光），cy3（橙紅色熒光），cy5（紅色熒光），德克薩斯紅（橙紅色熒光）較常用。,page 34,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,免疫熒光細胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補體法四種。,1、直接法： 1）檢查抗原法：（最早的方法） 用已知的特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。 該方

26、法很特異和簡便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。 2）檢查抗體法： 將抗原標記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測出來。,page 35,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,2、間接法： 1）檢查抗體法（夾心法） 先用特異性抗原與細胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間。 2）檢查抗體法 用已知抗原細胞或組織標本的切片，加上待測血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性igg熒光抗體）與結(jié)合在抗原上

27、的抗體反應(yīng)（如檢測人血清中的抗體必需用抗人igg熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。,page 36,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,3）檢查抗原法雙薄片 先用特異性（對細胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱第一抗體）與細胞標本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（第二抗體，有種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。 由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細胞抗原上每個分子結(jié)合35個分子抗體，當此

28、抗體作為抗原時又可結(jié)合35個分子的熒光抗體，所以與直接法相比熒光亮度可增強34倍。 靈敏度高，只需制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示。是目前使用得最廣泛的技術(shù)。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。,page 37,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,3、補體法 1）直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法 用抗補體c3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補體反應(yīng)，而形成抗原抗體補體復(fù)合物 抗補體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢等。 2）間接檢查組織內(nèi)抗原法 常將新鮮補體與第一抗體混合同時

29、加在抗原標本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生抗原補體抗體反應(yīng)，補體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補體熒光抗體與結(jié)合的補體反應(yīng)，形成抗原抗體抗補體熒光抗體的復(fù)合物。 此法優(yōu)點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的標記顯示。缺點為容易出現(xiàn)非特異性染色反應(yīng)。,page 38,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,4、雙（多）重免疫熒光標記法 在同一細胞組織標本上需同時檢查兩種或兩種以上抗原時，要進行雙（多）重熒光染色。 一般均采用直接法。將這些熒光抗體（如抗a和抗b）以適當比例混合，加在標本上（也可分別加），孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體。不同熒光標記抗體最好用波長范圍

30、分得比較開的熒光素。如綠色與紅色搭配。,page 39,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,page 40,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,研究中常用熒光染料和探針,細胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標記： 與抗體耦聯(lián), 直標: 一抗+熒光探針 間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗體+熒光探針) 肌動蛋白actin ( palloidine+熒光探針) 1染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價的熒光抗體，在室溫或37染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。 2洗片 傾去存留的熒光抗體，將切片浸入p

31、h7.4或ph7.2pbs中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。 3用50%緩沖（0.5mol/l碳酸鹽緩沖液ph9.09.5）甘油封固、鏡檢,page 41,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,研究中常用熒光染料和探針,細胞膜表面受體 配體+熒光探針 如: nachr、machr、多巴胺受體(d1,d2) 標記 gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+fitc 1 .切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37作用30min。然后用0.01mol/l ph7.2pbs洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液

32、體。 2 .再滴加間接熒光抗體，染色30min，37，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。,page 42,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,研究中常用熒光染料和探針,1.amine-reactive probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等 green red fura-red fitc 494/518 tritc 544/572 cy5 650/690 (異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明) alexa fluor 488 488/530 pe 565/578 (藻紅

33、蛋白) texas red 595/615 (德州紅) cy3 558/568 bodipy fl 503/512 bodipy tmr 543/569 bodipy tr 592/618,page 43,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,研究中常用熒光染料和探針,2.標記細胞器熒光探針 1)線粒體 mitochondria rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子, 可檢 測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細胞中停留 時間短 jc1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光 可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針 mitotracker green fm 490/516, 染活細胞或固定細胞 , 穩(wěn)定不漏出 mitotracker orange cmtmros 551/576, (氧化型) mitotracker orange 還原型, 只能染活細胞,page 44,熒光細胞化學(xué)樣品制備和檢測技術(shù),28.07.2020,研究中常用熒光染料和探針,2)溶酶體 lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官 為非特異性 ao : lysotracker green dnd-26 504/511, 染活細胞 lysotracker blue lysotr