1、第45講生物技術在其他方面的應用考綱要求1.植物的組織培養(yǎng)。2.PCR技術的基本操作和應用。3.蛋白質的提取和分離。4.從生物材料中提取某些特定的成分。5.實驗：DNA的粗提取與鑒定?？键c一植物組織培養(yǎng)1植物組織培養(yǎng)的過程外植體愈傷組織幼苗移栽植物組織培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，一般需要添加生長素和細胞分裂素兩種植物激素。2植物組織培養(yǎng)的實驗操作(1)菊花的組織培養(yǎng)過程制備MS培養(yǎng)基(配制母液、配制培養(yǎng)基、滅菌)外植體消毒接種培養(yǎng)移栽栽培。(2)月季的花藥培養(yǎng)過程過程：材料的選取材料的消毒接種和培養(yǎng)鑒定和篩選。影響花藥培養(yǎng)的因素主要有材料的選擇和培養(yǎng)基的組成。要挑選完全未開放的花蕾，確定花粉

2、發(fā)育時期最常用的方法是醋酸洋紅法。3影響植物組織培養(yǎng)的因素(1)菊花的組織培養(yǎng)，一般選擇開花植株的莖上部新萌生的側枝()(2)植物激素的濃度可影響細胞分化，但使用的先后順序及比例不影響組織培養(yǎng)的過程()(3)pH、溫度和光照等也影響植物組織培養(yǎng)()易錯警示實驗操作中易錯的幾個問題 (1)材料的選取：菊花的組織培養(yǎng)實驗中，應選擇未開花植株的莖上部新萌生的側枝；月季的花藥培養(yǎng)實驗中，應選擇花粉發(fā)育過程中的單核靠邊期的花粉進行培養(yǎng)。(2)外植體消毒：所用消毒劑為體積分數(shù)為70%的酒精和質量分數(shù)為0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是無菌水。(3)培養(yǎng)過程：在初期，菊花的組織培養(yǎng)需光照，月季的花藥培養(yǎng)

3、不需光照；而在后期均需光照。1植物的花藥培養(yǎng)在育種上有特殊的意義。植物組織培養(yǎng)可用于無病毒植株及細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等方面。請回答相關問題：(1)利用月季的花藥離體培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體時，選材非常重要。一般來說，在_期花藥培養(yǎng)的成功率最高。為了選擇該期的花藥，通常選擇_的花蕾。確定花粉發(fā)育時期最常用的方法有_法，但是對于花粉細胞核不易著色的植物，需采用_法，該法能將花粉細胞核染成_色。(2)若要進行蘭花無病毒植株的培育，首先選擇蘭花的_作為外植體。從外植體到無病毒植株試管苗，要人為控制細胞的_和_過程。(3)進行組織培養(yǎng)需配制MS培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中常需要添加_、_等植物激素。欲有利于根的分化，植物

4、激素的用量比例應為_。(4)不同植物的組織培養(yǎng)除需營養(yǎng)和激素外，_等外界條件也很重要。(5)無菌技術也是成功誘導出花粉植株的重要因素，下列各項中使用化學藥劑進行消毒的是_，采用灼燒方法進行滅菌的是_。(填序號)培養(yǎng)皿培養(yǎng)基實驗操作的雙手三角錐形瓶接種環(huán)花蕾答案(1)單核靠邊完全未開放醋酸洋紅焙花青鉻礬藍黑(2)莖尖分生組織脫分化(或去分化)再分化(3)生長素細胞分裂素(兩空順序可以顛倒)生長素多于細胞分裂素(4)pH、溫度和光照(5)解析(1)早期的花藥比后期的更容易培養(yǎng)成功。一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高。該時期的花藥通常存在于完全未開放的花蕾中。(2

5、)根尖、莖尖約00.1 mm區(qū)域中幾乎不含病毒。病毒通過維管系統(tǒng)移動，而分生組織中不存在維管系統(tǒng)，且莖尖分生組織中，代謝活力高，競爭中病毒復制處于劣勢。(3)生長素與細胞分裂素等植物激素可調(diào)節(jié)脫分化和再分化。當生長素含量多于細胞分裂素含量時，利于生根。(4)植物培養(yǎng)時，除需要營養(yǎng)、激素外，還需要適宜的溫度、pH和光照等。(5)對實驗器具進行滅菌處理，對實驗過程中的具有生物活性的材料或用具進行消毒處理。1植物組織培養(yǎng)技術和花藥離體培養(yǎng)技術的異同 項目內(nèi)容菊花的組織培養(yǎng)月季的花藥培養(yǎng)理論依據(jù)植物細胞的全能性基本過程脫分化再分化外植體的細胞類型體細胞生殖細胞操作流程制備培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)移栽栽

6、培選材消毒接種和培養(yǎng)篩選和誘導移栽栽培選育影響因素選材、營養(yǎng)、植物激素、pH、溫度、陽光等培養(yǎng)結果正常植株單倍體植株生殖方式無性生殖有性生殖可育性可育高度不育，秋水仙素處理后可育2植物激素與組織培養(yǎng)(1)生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素，其作用及特點：在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強的趨勢。使用順序不同，結果不同，具體如下：使用順序實驗結果先使用生長素，后使用細胞分裂素有利于細胞分裂，但細胞不分化先使用細胞分裂素，后使用生長素細胞既分裂也分化同時使用分化頻率提高用量比例不同，結果也不同3影響植物組織培養(yǎng)的因素(1)材料：植物的種類、材料的年齡和保存時間

7、的長短等都會影響實驗結果。一般來說，容易進行無性繁殖的植物容易進行組織培養(yǎng)。嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導脫分化和再分化。(2)營養(yǎng)：常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有機物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。(3)環(huán)境條件：pH、溫度、光照等條件。如菊花的組織培養(yǎng)所需pH為5.8左右，溫度為1822 ，光照條件為每日用日光燈照射12 h?？键c二DNA的粗提取與鑒定1基本原理2操作過程 材料的選取：選用DNA含量相對較高的生物組織去除雜質：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度的 不同，通過控制NaC

8、l溶液的濃度去除雜質DNA的鑒定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，沸水中加熱5 min，溶液變成藍色易錯警示(1)本實驗不能用哺乳動物成熟紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟紅細胞無細胞核?？蛇x用雞血細胞作材料。(2)實驗中兩次使用蒸餾水，第一次的目的是使成熟的雞血細胞漲破釋放出DNA，第二次的目的是稀釋NaCl溶液，使DNA從溶液中析出。2下圖表示以雞血為實驗材料進行DNA的粗提取與鑒定的操作程序，請分析回答下列問題：(1)步驟一中，向雞血細胞液中加入_并攪拌，可使雞血細胞破裂。(2)步驟二中，過濾后收集含有DNA的_。(3)步驟三、四的操作原理是_；步驟四中，通過向溶液中加入_調(diào)節(jié)Na

9、Cl溶液的物質的量濃度至_mol/L時，DNA將會析出，過濾去除溶液中的雜質。(4)步驟七：向步驟六過濾后的_中加入等體積的冷卻的_，靜置23 min，溶液中會出現(xiàn)_色絲狀物，這就是粗提取的DNA。(5)步驟七：DNA遇_試劑，沸水浴5 min，冷卻后，溶液呈_色。答案(1)蒸餾水(2)濾液(3)DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質蒸餾水0.14(4)濾液酒精白(5)二苯胺藍解析破碎紅細胞應用蒸餾水，使之吸水漲破。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，在0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA析出?？赏?/p>

10、過加入蒸餾水將2 mol/L的NaCl溶液稀釋為0.14 mol/L的NaCl溶液。DNA不溶于冷酒精，遇二苯胺加熱呈藍色。1DNA與蛋白質在NaCl溶液中溶解度比較2 mol/L NaCl溶液0.14 mol/L NaCl溶液溶解規(guī)律DNA溶解析出蛋白質部分發(fā)生鹽析沉淀溶解NaCl溶液從2 mol/L降低過程中，溶解度逐漸增大2DNA粗提取與鑒定中不同試劑的用途及原理比較試劑濃度用途原理(“”為實驗的主要原理)NaCl溶液2 mol/L溶解DNADNA在NaCl溶液中的溶解度隨溶液濃度的變化而改變，溶解度在2 mol/L時最大、在0.14 mol/L時最小0.14 mol/L析出DNA2 m

11、ol/L鑒定時的溶劑酒精95%(體積分數(shù))除去雜質以提純DNADNA不溶于酒精，但是細胞中的某些物質可以溶于酒精二苯胺鑒定劑DNA遇二苯胺(沸水浴)會變藍色檸檬酸鈉0.03 g/mL抗凝劑除去血液中的鈣離子，防止血液凝固3DNA粗提取實驗材料和方法的選擇(1)不同生物的組織中DNA含量不同在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。(2)材料不同所采用的提取方法不同植物組織：取材研磨過濾沉淀。雞血：制備雞血細胞液提取核DNA溶解細胞核內(nèi)DNA析出并濾取DNADNA再溶解提取較純凈的DNA?？键c三PCR技術的基本操作和應用1PCR原理DNA熱變性原理，即：2PCR反應過程(1)變

12、性：當溫度上升到90_以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。(2)復性：溫度下降到55_左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。(3)延伸：溫度上升到72 左右時，溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。易錯警示(1)DNA分子復制的人工控制解開螺旋：在80100 時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性。恢復螺旋：在50 左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。復制條件：緩沖液、DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶和兩種引物。反應場所：PCR儀。(2)PCR技術中的引物：含義：引物是一小段單鏈

13、DNA或RNA分子。作用：為DNA聚合酶提供合成的3端起點。種類：擴增一個DNA分子需要2種引物。數(shù)目：引物數(shù)目等于新合成的DNA子鏈數(shù)目。與DNA母鏈的關系：兩種引物分別與DNA母鏈的3端通過堿基互補配對結合。3多聚酶鏈式反應(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。請回答下列有關PCR技術的基本原理及應用問題：(1)DNA的兩條鏈是反向平行的，通常將_的末端稱為5端，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結合后，DNA聚合酶就能從引物的_開始延伸DNA鏈。(2)PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，但又導致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀80年代，科學家從一種Taq

14、細菌中分離到_，它的發(fā)現(xiàn)和應用解決了上述問題。要將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來，所用的培養(yǎng)基叫_。(3)PCR的每次循環(huán)可以分為_三步。假設在PCR反應中，只有一個DNA片段作為模板，請計算在5次循環(huán)后，反應物中大約有_個這樣的DNA片段。(4)請用簡圖表示出一個DNA片段PCR反應中第二輪的產(chǎn)物。(5)簡述PCR技術的主要應用。_。答案(1)磷酸基團3端(2)耐高溫的Taq DNA聚合酶選擇培養(yǎng)基(3)變性、復性和延伸32(4)如圖所示(5)遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定(要求3項以上)解析(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已經(jīng)存在的核酸的3羥基上

15、，與DNA母鏈結合的引物就提供這個羥基。(2)因PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題，所以用于催化DNA復制過程的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇培養(yǎng)基可將Taq細菌從其他普通的微生物中分離出來。(3)DNA復制時兩條鏈均作為模板，進行半保留復制，所以復制5次后得到的子代DNA分子數(shù)為2532個。(4)新合成的DNA鏈帶有引物，而最初的模板DNA的兩條鏈不帶有引物。(5)PCR技術可以對DNA分子進行擴增，所以可用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等方面。1細胞內(nèi)DNA復制與PCR技術的比較細胞內(nèi)DNA復制PCR不同點解旋在DNA解旋酶作用

16、下，邊解旋邊復制80100 高溫解旋，雙鏈完全分開酶DNA解旋酶、DNA聚合酶Taq DNA聚合酶引物RNADNA或RNA溫度體內(nèi)溫和條件高溫相同點需提供DNA復制的模板四種脫氧核苷酸為原料子鏈延伸的方向都是從5端到3端2PCR的反應過程(1)變性：當溫度上升到90 以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，如下圖：(2)復性：溫度下降到50 左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合，如下圖：(3)延伸：溫度上升到72 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈，如下圖：考點四血紅蛋白的提取和分離1血紅蛋白的提取和分離原理及方法(1)原理：蛋白質各種

17、特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度、吸附性質和對其他分子的親和力等，可以用來分離不同種類的蛋白質。(2)分離方法凝膠色譜法：也稱做分配色譜法，是根據(jù)相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。電泳法：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。常用的電泳法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。2血紅蛋白的提取和分離過程樣品處理：紅細胞的洗滌血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液純化：用凝膠色譜法分離相對分子質量不同的蛋白質3判斷正誤(1)利用凝膠色譜法分離蛋白質時，相對分子質量小的先洗脫出來()(2)在電泳過程中，蛋白質分子的移動速度，與分子本身的大小和形狀無關，而與所帶電荷的

18、差異有關()(3)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，電泳遷移率完全取決于分子的大小()易錯警示“血紅蛋白的提取和分離實驗”中的注意事項(1)紅細胞的洗滌：洗滌次數(shù)不能過少，否則無法除去血漿蛋白；要低速、短時離心，否則會使白細胞等一同沉淀，達不到分離的效果。(2)凝膠的預處理：用沸水浴法不但節(jié)約時間，而且除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。(3)色譜柱的裝填：裝填時盡量緊密，減小顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。(4)色譜柱成功的標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。4紅細胞中含有大量的血紅蛋白，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗來提取和分離血紅蛋白。下列對血紅蛋白提取和分離的敘述

19、，錯誤的是()A血紅蛋白提取和分離一般按照樣品處理粗分離純化純度鑒定的順序進行B純化過程中要用生理鹽水充分溶脹凝膠來配制凝膠懸浮液C粗分離中透析的目的是去除相對分子質量較小的雜質D可經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定答案B解析蛋白質的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。提取和分離血紅蛋白時，首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品處理；再通過透析法除去相對分子質量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量較大的雜蛋白除去，即樣品純化，純化過程中凝膠應用蒸餾水充分溶脹后，配制成凝膠懸浮液，而不是用生理鹽水；最后經(jīng)SDS聚

20、丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。1常用的蛋白質分離方法(1)凝膠色譜法蛋白質項目相對分子質量大相對分子質量小凝膠內(nèi)部不能進入能進入運動方式垂直向下垂直向下和無規(guī)則擴散運動經(jīng)過路程較短較長洗脫次序先流出后流出(2)電泳法原理在一定pH下，蛋白質分子的某些基團解離后帶上正電或負電。在電場的作用下，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。由于待分離樣品中各種分子帶電性質的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。2分離DNA、PCR技術、分離蛋白質的比較分離DNAPCR技術分離蛋白質實驗原理DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精

21、利用DNA熱變性原理體外擴增DNA依據(jù)相對分子質量的大小不同來分離蛋白質實驗過程選取材料破碎細胞釋放DNA除雜DNA析出與鑒定變性復性延伸樣品處理凝膠色譜操作實驗結果獲得較純凈的DNA獲得大量DNA相對分子質量不同的蛋白質得以分離實驗意義為DNA研究打下基礎解決了DNA研究中材料不足的問題為蛋白質的研究和利用提供了原材料3比較瓊脂糖凝膠電泳和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)從載體上看，利用瓊脂糖凝膠作為載體的是瓊脂糖凝膠電泳，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠作為載體的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(2)從依據(jù)上看，利用了分子帶電性質差異和分子大小的是瓊脂糖凝膠電泳，僅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝膠

22、電泳。(3)從優(yōu)點上看，瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需處理，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了凈電荷對遷移率的影響，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。考點五植物有效成分的提取1植物芳香油的提取(1)提取玫瑰精油實驗方法：水蒸氣蒸餾法。實驗流程(2)提取橘皮精油的實驗方法：一般用壓榨法。實驗流程2胡蘿卜素的提取(1)胡蘿卜素性質：不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有機溶劑。(2)實驗設計方法：萃取法，石油醚最適宜作萃取劑。實驗流程(3)鑒定方法：紙層析法。易錯警示胡蘿卜素粗品鑒定過程中的5個易錯點(1)層析時沒有選擇干凈的濾紙，導致實驗現(xiàn)象不明顯：為

23、了防止操作時對濾紙的污染，應盡量避免用手直接接觸濾紙，可以戴手套進行操作。(2)點樣時點樣圓點太大(直徑大于2 mm)，導致最終在濾紙上形成一條線，無法辨認被提取的色素：點樣圓點的直徑應為2 mm。(3)將點好樣的濾紙卷成筒狀，卷紙時不能將濾紙兩邊相互接觸：以避免由于毛細管現(xiàn)象導致溶劑沿濾紙兩邊的移動加快，溶劑前沿不齊，影響結果。(4)層析液沒及樣品原點，色素溶解于層析液中，造成實驗失?。簩游鲆翰豢蓻]及樣品原點，以免色素溶解于層析液中，使鑒定失敗。(5)沒設置標準樣品作對照：層析液中是否提取到胡蘿卜素，可通過與標準樣品中的胡蘿卜素作對比予以確認。5請回答下列與實驗室提取芳香油有關的問題：(1)植物芳香油的提