1、微生物分類與鑒定,總學時：32 倪志婧 ,微生物分類的基本理論 微生物分類學(microbial taxonomy):研究微生物分類理論和技術(shù)方法的學科 分類(classification)： 根據(jù)一定的原則(表型特征相似性或系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性)對微生物進行分群歸類，根據(jù)相似性或相關(guān)性水平排列成系統(tǒng)，并 對各個分類群的特征進行描述，以便查考和對未被分類的微生物進行鑒定。 -根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)的過程,地球上的物種估計大約有150萬，其中微生物超過10萬種，而且其數(shù)目還在不斷增加。,第一章 微生物分類學 細菌分類學,第一節(jié) 細菌分類學概述,一、細菌分類鑒定的意義 細菌分類學的任務(wù)是在全面了解細菌的生

2、物學特征的基礎(chǔ)上，研究他們的種類，探索其起源、演化以及與其他類群之間的親緣關(guān)系，進而提出能反映自然發(fā)展的分類系統(tǒng)，并將微生物加以分門別類。,二、細菌分類學研究簡史 1675年，荷蘭人用自制顯微鏡觀察到“微小動物” 第一個嘗試生物分類的科學家林奈 丹麥動物學家Muller提出新的分類系統(tǒng)，其中包括動物、藻類、細菌。并建議將細菌分為單胞菌屬和弧菌屬。 1838年，德國生物學家Eheneberg對微生物分類做了修改，把細菌列為纖毛蟲綱，分為2科。,1857年，德國植物學家Nagali在植物學雜志上發(fā)表文章指出，這些微生物具有細胞壁，應(yīng)歸屬于植物界，并獨立設(shè)一綱，取名裂殖菌綱。 1872年，德國植物學

3、家Cohn發(fā)表新的細菌分類系統(tǒng)，吧細菌分為4個族，每個族由一個或幾個屬組成。 1909年，Jensen發(fā)表了一種新的分類法，該方法在采用形態(tài)和病原性特征的同時，還依據(jù)細菌的代謝活性,將裂殖菌綱分為2個目：端叢毛菌目和周毛菌目。,1915年，美國生物學家Buchanan對細菌的命名和分類進行了一系列研究，他根據(jù)形態(tài)、染色反應(yīng)、生理生化特征及病原性等多方面特征，把細菌分成科、族、屬。 1917年，美國細菌學家協(xié)會組成細鑒定和分類委員會，直接編撰了伯杰細菌鑒定手冊 本世紀40-50年代，細菌分類學增加了生理學、生物化學的實驗及營養(yǎng)要求等。同期，分類學從描述性的定性水平提高到精確地定量水平。 1957

4、年，英國細菌學家Sneath首先把電子計算機應(yīng)用于細菌分類，開創(chuàng)了數(shù)值分類法。,本世紀60年代，細菌分類進入分子生物學時期。開創(chuàng)了細菌分類的第三紀元，深入的研究和分析細菌的化學結(jié)構(gòu)和核酸。 當前，已經(jīng)在細菌分類單元采用rRNA基因分析，以確定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。目前，細菌分類學家主要還是用DNA同源性來定種，并參考16sRNA基因序列分析相似性以定屬。,三、細菌分類學研究發(fā)展趨勢 (1) 分析方法的標準化(2) 多相分類方法的廣泛應(yīng)用及分子分類法的發(fā)展(3) “在線分類”的發(fā)展(4) 分類學研究與細菌資源研究結(jié)合,第二節(jié) 細菌分類的基本原理,一、細菌分類的原則 分類有兩種： 以細菌的形態(tài)和生理生化

5、特性為依據(jù)的表型特征分類法，包括有傳統(tǒng)分類法（classical classification）和數(shù)值分類法(numericalclassification)； 用化學分析和核酸分析，以細菌大分子物質(zhì)（核酸、蛋白質(zhì)）結(jié)構(gòu)的同源程度進行分類稱種系分類（phylogenetic classification）或自然分類（natural classfication）。,從進化論誕生以來，已經(jīng)成生物學家普遍接受的分類原則,生物系統(tǒng)學(systematics),分類原則：當前細菌的分類，不管是哪個系統(tǒng)，都還是按照形態(tài)為主（尤其是目、屬、科的分類）生理生化為輔的原則，結(jié)合生態(tài)學核細胞化學組分及分子生物學方

6、面的特征及基因序列分析進行各級分類單位的劃分。,二、細菌的分類單元和命名規(guī)則 （一）細菌分類單元 細菌的分類等級和其他生物相同，依次為界（kingdom）、門（division）、綱（class）、目（order）、科（family）、屬（genus）、種（species）。細菌屬于原核生物界（procaryotae），包括有細菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體和螺旋體。,1. 種以上的系統(tǒng)分類單元,一、分類單元及其等級,界 （Kingdom） (Regnum),門 （Phylum） (Phylum),綱（Class） (Classis),目（Order） (Ordo),科（Family）

7、(Familia),屬（Genus） (Genus),種（Species） (Species),種是細菌分類的基本單位，將生物學性狀基本相同的細菌群體歸成一個菌種；性狀相近、關(guān)系密切的若干菌種組成一個菌屬；相近的屬歸為一科；依次類推。在兩個等級之間，可添加次要的分類單位，如亞門、亞綱、亞屬和亞種等。群和組不是正式分類等級，是泛指具有某種共同特性的某個集體，任何等級都可借用。同一菌種的各個細菌，在某些方面仍有一定的差異，可再分成亞種（subspecies），亞種以下的分類等級為型（type），以區(qū)別某些特殊的特征。,（1）種（species）物種，生物分類中基本的分類單元,常用的細菌分類學術(shù)語：

8、,高等生物中，“生殖隔離”被看作是區(qū)分物種的標準,微生物的種：具有高度特征相似性的菌株群，這個菌株群與其他類群的菌株有很明顯的區(qū)別。,(2). 亞種(subspecies): 是正式分類單元中地位最低的分類等級。 當某一個種內(nèi)的不同菌株存在少數(shù)明顯而穩(wěn)定的變異特征或遺傳性狀而又不足以區(qū)分成新種時，可以將這些菌株細分成兩個或更多的小的分類單元-亞種。,(3).型(form或type：亞種以下的等級)：常指亞種以下的細分。當同種或同亞種不同菌株之間的性狀存在差異，不足以分為新的亞種時，可以細分為不同的型。 中文譯名 推薦使用的名稱 以前使用的同義詞 應(yīng)用于只有下列性狀的菌株 生物型 biovar

9、biotype 特殊的生理生化性狀 血清型 serovar serotype 不同的抗原特征 致病型 pathovar pathotype 對宿主致病性的差異 噬菌型 phagovar phagotype 對噬菌體溶解反應(yīng)的差異 形態(tài)型 morphovar phagotype lysotype特殊的形態(tài)學特征,（4）菌株(strain)：在一個特定分類學中至少與其他一些群體是可以區(qū)別的生物群體。是來自單個或純培養(yǎng)物的微生物，一個種內(nèi)菌株間在許多方面有小差別。 例如：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的2個菌株： Bacillus subtilis AS1.398：蛋白酶生產(chǎn) B

10、acillus subtilis BF 7658：-淀粉酶生產(chǎn)菌,菌株與型的區(qū)別 ： 菌株之間不存在鑒別性特征的差異，命名不同的菌株無需分類學依據(jù)； 不同型的細菌之間存在鑒別性特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學依據(jù)。,(5). 群(group), 組(section), 系(series):這些類群名稱用在不同場合，常常有非常不同的含義，可以是種水平上的類群，也可以代表屬以上等級的分類 單元的集合。如伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第一版中，主要根據(jù)表型特征將全部原核生物分為33組。將假單胞菌屬(Pseudomonas)內(nèi)的90個種分為5組。 1,（6）培養(yǎng)物(culture)：一定時間一定空間內(nèi)

11、微生物的細胞群或生長物。如微生物的斜面培養(yǎng)物、搖瓶培養(yǎng)物等。,（二）細菌分類單元的命名規(guī)則 國際細菌命名法規(guī) 1、分類單元的命名法：雙名法 所有正式分類單元的學名, 必須用拉丁詞或其他詞源經(jīng)拉丁化的詞命名，要求印刷成斜體，書寫時在名稱下面加下劃線 屬名: 一般拉丁字名詞，字首字母大寫, 例如：Bacillus(芽孢桿菌屬)，拉丁詞，原意為小桿菌，因該屬菌 有芽孢而譯為 芽孢桿菌屬。 Clostridium(梭菌屬)，源于希臘詞，原意為紡綞狀菌。,種名: 林奈氏雙名法，由二個拉丁字組成，屬名(字首字母大寫) + 種名加詞(全部小寫) 如： Pseudomonas aeruginosa (銅綠色假

12、單胞菌） 其中 Pseudomonas 是屬名(假單胞菌屬)(陰性 )； aeruginosa 是種名加詞，是拉丁語形容詞(陰性)， 原意為銅綠色的。,當泛指某一屬細菌而不特指該屬中的某一個種(或 種名未定)時，可在屬名后加sp.或spp.(分別代表 species縮寫的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式) 例如 Bacillus sp.(一種芽孢桿菌） Bacillus spp.(一些芽孢桿菌） 在發(fā)表新的分類單元名稱時，要再新名稱后面加上新分類單元的縮寫詞。 如果該菌以前被人命名過，則把原命名人的姓氏寫在括號里。,命名法則 1) 所有正式分類單元的學名, 必須用拉丁詞或拉丁化的詞命名. 2) 屬名:字首字母大

13、寫 3) 種名: 二元式組合 屬名+種名加詞 4) 亞種名: 三元式組合屬名+種名加詞+ subsp.亞種名加詞 5) 屬級以上分類單元的名稱 :特定的詞尾 6) 屬名, 種名, 亞種名印刷體一律斜體.,2、新名稱的合格發(fā)表 國際細菌命名法規(guī)規(guī)定，新的細菌名稱必須在IJSB發(fā)表后，經(jīng)過世界公認的國際細菌命名裁定委員會公布，菌名批準目錄刊登后正式應(yīng)用。凡有關(guān)細菌研究的學術(shù)論文必須使用上述正式命名的細菌學名。 合法性：分類單元的名稱必須符合命名法規(guī)的規(guī)則 發(fā)表優(yōu)先權(quán)：種以上至目并包括目的各分類單元只能有一份正確名稱，即符合國際細菌命名法規(guī)的最早的那個名稱。 有效發(fā)表：指通過出售或者分發(fā)印刷材料，使

14、科學界普遍了解，其目的在于提供一個永久的記錄。,3. 命名模式及其指定 由于細菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統(tǒng)一標準，為了減少因采用不同標準界定分類單元所造成的混亂，細菌系統(tǒng)分類也像其他生物分類一樣采用“模式概念 根據(jù)命名法規(guī)要求，正式命名的分類單元應(yīng)指定一個命名模式(簡稱模式)作為該分類單元命名的依據(jù)。 即：首先，指出或指定一個模式。然后，根據(jù)模式來進行分類單元的命名。,命名模式的指定 種和亞種指定模式菌株（type strain）；即首先指定模式菌株（它是有名稱的），它是種名的命名依據(jù)，也 是該種眾多菌株中的一員。 亞屬和屬指定模式種（type species）；一個屬名的模式就是使此

15、名稱得以合格發(fā)表時用來做原始 描述的種 科及科以上至目級分類單元指定模式屬（type genus）；一個科或更高級分類群的名稱的模式，就是那些使名稱得 以合格發(fā)表時用來做原始描述的屬。,模式菌株應(yīng)送交菌種保藏機構(gòu)保藏，以便備查考和索取。,三、細菌的分類系統(tǒng) （一）克里希里尼科夫分類系統(tǒng) 植物界原生動物門下分為裂殖藻類和裂殖菌類，細菌歸為裂殖菌類，下分四綱，分別為放線菌綱、真細菌綱、粘細菌綱、和螺旋體綱。 （二）普雷沃分類系統(tǒng) 把細菌歸為原核生物界，下分四個門8個綱，即真細菌門（無芽孢菌綱、芽孢菌綱）、分枝桿菌綱（放線菌綱、粘細菌綱、固氮細菌綱）、藻桿菌綱（鐵桿菌綱、硫桿菌綱）和原生動物形細菌門

16、（螺旋體綱）,（三）伯杰氏分類系統(tǒng)：最權(quán)威且當前國際普遍采用的分類系統(tǒng)。伯杰氏細菌鑒定手冊是本分類系統(tǒng)的標準指南，由美國細菌學家協(xié)會（現(xiàn)在的美國微生物學會）發(fā)起編寫，最初指定伯杰作為編委會主席，并在1923年出版了手冊的第1版，定名為伯杰氏鑒定細菌學手冊。 第一版（1923年） 第八版（1974年） 第九版（1994年）,美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937),19841989年改為伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊，簡稱系統(tǒng)手冊 (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology) 第一版，分四卷 第二版，分五卷（根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育資料，對

17、分類單元進行了相當大的調(diào)整，將細菌分成兩個域共25門39綱） 第一卷：古生菌、藍細菌、光合細菌以及最早分支的細菌 第二卷：變形桿菌（包括形態(tài)及生理學特征多樣的革氏陰性菌） 第三卷：低G+C含量的革氏陽性菌 第四卷：高G+C含量的革氏陽性菌 第五卷：浮霉狀菌、螺旋體、絲桿菌、擬桿菌和衣原體等,伯杰氏鑒定細菌學手冊 (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology) 1994年出版的伯杰氏鑒定細菌學手冊第9版幾乎是伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊的縮寫版，除了對細菌各屬關(guān)鍵表觀特征的描述外，屬內(nèi)各種的鑒定特征以表格的形式出現(xiàn)。這對于鑒定工作十分方便。鑒定手冊共包括四個

18、類別，35群細菌，群的劃分根據(jù)表觀特征如形態(tài)、生理和營養(yǎng)類型。,伯杰氏手冊: 是目前進行細菌分類、鑒定的最重要參考書，其特點是描述非常詳細，包括對細菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法。,名詞解釋 亞種 型 菌株 雙名法 簡述細菌分類的原則 簡述細菌三大分類系統(tǒng),第三節(jié) 細菌的分類特征和細菌鑒定,一、細菌鑒定的依據(jù) 細菌鑒定：將未知細菌按分類原則放入系統(tǒng)中某一適當位置和已知細菌比較其相似性，用對比分析方法確定細菌的分類地位。若與已知細菌相同即采用已知菌的名稱，不同者則按命名原則確定一個新名稱。 主要依據(jù)是形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征及血清反應(yīng)及噬菌體敏感性等。,二、細菌的分類特

19、征 （一）、個體形態(tài)特征 細胞形態(tài)：個體大小(其中最重要的是細胞的寬度或直徑)排列(單個、成對、成鏈或其他特殊排列方式)、個體形狀(球形、桿狀、弧形、螺旋形、絲狀、分枝及特殊形狀) 特殊的細胞結(jié)構(gòu)：“鞭毛（有無鞭毛、著生位置及其數(shù)量)；芽孢（有無芽孢、形狀、著生位置、孢囊是否膨太)；孢子(孢子形狀、著生位置、數(shù)量及排列)：其他(莢膜、細胞附屬物為柄、絲狀物、鞘、藍細菌的異形胞、靜止細胞和連鎖體等)；超微結(jié)構(gòu)(細胞壁、細胞內(nèi)膜系統(tǒng)、放線菌孢子表面特征等),細胞內(nèi)含物：異染顆粒、聚D一羥丁酸等類脂顆粒、硫粒、氣泡、伴孢晶體等 染色反應(yīng)：革蘭氏染色、抗酸性染色 運動性：鞭毛泳動、滑行、螺旋體運動方式

20、,（二）、培養(yǎng)特征 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、半固體培養(yǎng)基中的穿刺生長情況（需氧性、運動性）液體培養(yǎng)情況及明膠培養(yǎng)（胨化及其形狀） 如菌落的形狀、太小、顏色、隆起、表面狀況、質(zhì)地、光澤、水溶性色素等 a）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌 b）許多形態(tài)學特征依賴于多基因的表達，具有相對的穩(wěn)定性,穿刺培養(yǎng)特征,（三）、生理生化反應(yīng) (1)營養(yǎng)類型：光能自養(yǎng)異養(yǎng)、化能自養(yǎng)異養(yǎng)及兼性營養(yǎng)型 (2)氮源的利用能力：對蛋白質(zhì)胨、氨基酸、含氮無機鹽、N2等的利用 (3)碳源的利用能力：對各種單雙多糖以及醇類、有機酸等的利用,(4)對生長因子的需要：對特殊維生素、氨基酸等的依賴性 (5)

21、需氧性：好氧、微好氧、厭氧及兼性厭氧 (6)對溫度的適應(yīng)性：最適、最低及最高生長溫度及致死溫度,(7)對pH的適應(yīng)性：在一定pH條件下的生長能力及生長的pH范圍 (8)對滲透壓的適應(yīng)性：對鹽濃度的耐受性或嗜鹽性 (9)對抗生素及抑菌劑的敏感性：對抗生素、氰化鉀(鈉)、膽汁、弧菌抑制劑或某些染料的敏感性 (10)代謝產(chǎn)物：各種特征性代射產(chǎn)物 (11）酶反應(yīng):常用的有氧化酶和接觸酶，用于種、屬的區(qū)分與描述。,（四）、生態(tài)因子（與宿主的關(guān)系） 包括生境、寄生和致病性 值得強調(diào)的是，由于不少生理生化特征是染色體外遺傳因子編碼的、加上影響生理生化特征表達的因素比較復(fù)雜，所以根據(jù)生理生化特征來判斷親緣關(guān)系

22、進行系統(tǒng)分類時，必須與其他特征特別是基因型特征綜合分析，否則就可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)論。 五、細胞組分 六、血清反應(yīng)及噬菌體敏感性,群體：菌落形態(tài)，在半固體或液體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)等 形態(tài) 個體：細胞形態(tài)，染色反應(yīng)，各種特殊構(gòu)造等 營養(yǎng)要求：能源，碳源，氮源，生長因子等 生理、生化反應(yīng) 酶；產(chǎn)酶種類和反應(yīng)物性等 代謝產(chǎn)物：種類，產(chǎn)量，顯色反應(yīng)等 經(jīng)典指標 生態(tài)特性：生長溫度，對氧的需要，宿主種類等 生活史特點 血清學反應(yīng) 噬菌體的敏感性 其它,（五）、氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析 依據(jù)： (1)蛋白質(zhì)氨基酸序列的進化速率基本恒定。具有重要功能的蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子中的重要功能區(qū)域的氨基酸進化變化速率低。

23、 (2)同功能 相似性越高，其親緣關(guān)系越近。 常用于分類鑒定的蛋白分子靶點 ： (1)細胞色素和電子傳遞蛋白 (2)組蛋白 (3)熱休克蛋白 (4)轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白等,方法： 1. 氨基酸序列測定 2. 間接法：1）血清學 2）蛋白電泳圖譜比較蛋白指紋圖譜 （ 親緣關(guān)系相近的菌株，它們的圖譜也應(yīng)相似。蛋白質(zhì)指紋圖，已成功地應(yīng)用于種和種以下分類和 鑒定。對于屬以上分類單元的分類或鑒定效果較差。由于蛋白質(zhì)的表達受 環(huán)境因素的影響,標準的生長環(huán)境是必須的. ） 細菌分類鑒定研究中，常采用： 1）可溶性蛋白或全細胞蛋白提取液進行電泳圖譜比較； 2）比較同功酶或多位點酶的電泳遷移率,（六）、核酸的堿基組成

24、和分子雜交 特點： 與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對 DNA的堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結(jié) 果更加可信。,1. DNA的堿基組成(G+C mol%） DNA堿基組成：是各種生物一個穩(wěn)定的特征，即使個別基 因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。因此相似的堿基 組成，表明了親緣關(guān)系相近的一種可能性，也僅僅是可能 性。 分類學上，用(G+C mol%)來表示各類生物的DNA堿基組成 特征。(G+C mol%)：指GC堿基占全部堿基的摩爾百分 比,每個生物種都有特定的GC%范圍，因此后者可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25-75%，變化范圍最大

25、，因此更適合于細菌的分類鑒定。,1）每個物種都有特定的G+C mol%范圍，因此可以作為分類鑒 定的指標。細菌的GC mol%范圍為25-75%，變化范圍最大， 因此更適合于細菌的分類鑒定。 2）GC% 測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細菌作 出鑒定，檢驗表型特征分類的合理性，從分子水平 上判斷物種的親緣關(guān)系。 3）使用原則： GC含量比較在分類鑒定中的使用遵循否定原則,否定原則： （1）同一個種內(nèi)的不同菌株GC含量差別在45%以下。 否定原則：若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌 株，如果其G+C含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，即 將G+C含量差別大于常規(guī)值的菌株進行排除的原則。

26、 資料表明： （2）同屬不同種的差別應(yīng)低于1015%。 否定原則：被鑒定的菌株GC含量差別大于15%，則肯定不是 同一個屬,80年代以前螺菌屬(Spirillum)不同種的G+C含量范圍寬 達3866%，后來“伯杰氏手冊”(1984)結(jié)合其他特征已將其 分成三個屬：螺菌屬、海洋螺菌屬(Oceanospirillum)和水螺菌屬(Aquaspirillum) 。 它們G+C含量分別為38% 、42 51%和4966%； 過去根據(jù)形態(tài)學特征曾認為微球菌屬(Micrococcus)和 葡萄球菌屬(Staphylococcus)是關(guān)系很近的兩個屬，因而 長期放在一個科內(nèi)，由于G+C含量的差異(分別為3

27、038%和6475%)表明它們親緣關(guān)系相當遠，現(xiàn)在根據(jù)16S rRNA序 列資料已進行新的調(diào)整。,G+C含量的測定常用方法： （1） 熱變性溫度法熔點溫度（Tm）測定法 （2） 浮力密度離心法 （3） 高效液相色譜法,2. 核酸的分子雜交： 不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間 親緣關(guān)系的遠近，堿基排列順序差異越小，它們之 間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。 直接分析比較DNA的堿基排列順序 -由于技術(shù)上的困難目前尚難以普遍地進行； 核酸分子雜交( hybridization )： -間接比較不同微生物DNA堿基排列順序的相似性,2. 核酸的分子雜交： a）DNA-DNA 雜交:（親緣

28、關(guān)系相對近的微生物之間的親緣關(guān)系比較） b）DNA-rRNA 雜交:（親緣關(guān)系相對遠的微生物之間的親緣關(guān)系比較） 許多資料表明：DNA-DNA雜交同源性在 60% 以上的菌株可以 認為是同一個種；同源性超過70%為同一亞種；同源性在 2060%是同屬不同種的關(guān)系。,（七）、rRNA的序列分析 生物大分子蛋白質(zhì)、RNA和DNA序列，被看作是分子計時器(molecular chronometers)或進化鐘(evoluti onary clock)，它們真實地記錄了各種生物的進化過程。因此， 我們可以通過比較不同類群的生物大分子序列的改變量來 確定它們彼此系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性或進化距離。 在眾多的生物大

29、分子中，最適合于揭示各類生物親緣 關(guān)系的是rRNA，尤其是小核糖體亞單位RNA (16S rRNA, 18S rRNA)。,1）rRNA具有重要且恒定的生理功能； 2）在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度 變化的序列區(qū)域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研 究； 3）16S rRNA分子量大小適中，便于序列分析； 4）rRNA在細胞中含量大(約占細胞中RNA的90%)，也易于提?。?5）16S rRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是 18S rRNA)。因此它可以作為測量各類生物進化的工具。,16S rRNA序列測定與分析方

30、法： 1. 寡核苷酸編目分析法；（早期) 2. rRNA全序列測定分析法。 從早期的直接分離rRNA測序到目前的快速PCR擴增測序,（八）、化學分類特征 細胞化學成分用作鑒定的指標 : 細胞壁的化學成分:肽聚糖的氨基酸種類和糖類組分的變化對革蘭氏陽性菌分類很有價值。 全細胞水解液的糖型 磷酸類脂成分的分析 枝菌酸的分析 醌類的分析 氣相色譜技術(shù)（脂肪酸組成和代謝產(chǎn)物分析）,細菌的化學組分分析及其在分類水平上的應(yīng)用,細胞化學成分鑒定的意義,隨著分子生物學的發(fā)展，細胞化學組分分析用于微生物分類日趨顯示出重要性。細胞壁的氨基酸種類和數(shù)量現(xiàn)己被接受為細菌屬的水平的重要分類學標準。在放線菌分類中，細胞壁

31、成分和細胞特征性糖的分析作為分屬的依據(jù)，已被廣泛應(yīng)用。脂質(zhì)是區(qū)別細菌還是古菌的標準之一，細菌具有?；?( 脂鍵 ) ，而古菌具有醚鍵脂，因此醚鍵脂的存在可用以區(qū)分古菌。霉菌酸的分析測定己成為諾卡氏菌放線菌分類鑒定中的常規(guī)方法之一。鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇桿菌等細胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有無可作為此類細菌的一個重要標志。此外某些細菌原生質(zhì)膜中的異戊間二烯醌，細胞色素，以及紅外光譜等分析對于細菌、放線菌中某些科、屬、種的鑒定也都十分有價值。,三、細菌的鑒定 （一）、鑒定和分類的區(qū)別 從工作目的來看 分類是按相似性或同源性界定和排列分類單元，也就是確定分類單元在分類系統(tǒng)中的位置。鑒定是對分離物進

32、行識別。 鑒定方案是根據(jù)一群菌共同具有的（或缺少的）一個或多個特征為基礎(chǔ)制定出來的，因此，鑒定方案是在分類研究的基礎(chǔ)上制定出來的。 細菌鑒定種多采用特有的鑒別特征或?qū)嶒?，而不像分類工作那樣對分離物進行全面分析。鑒定中多選用形態(tài)和生理生化等表型特征。,（二）、檢索表：根據(jù)分類系統(tǒng)，找出各分類單元之間相互區(qū)分的一系列特征，構(gòu)成一個鑒定系統(tǒng)，即細菌鑒定的檢索表 檢索表有雙歧式檢索表和表格式兩種。,1細胞長絲狀，有分枝，形成暫時的或永久的菌絲體 放線菌亞綱 細胞球狀、桿狀、螺旋狀，也可呈長絲狀，但沒有真正的分枝，不形成菌絲體 2 2抗酸染色陽性 分枝桿菌屬（Mycobacterium） 抗酸染色陰性

33、3 3產(chǎn)生內(nèi)生芽孢 4 從不產(chǎn)生內(nèi)生芽孢 5 4接觸酶陽性，好氧或兼性厭氧 芽孢桿菌屬（Bacillus） 接觸酶陰性，厭氧或厭氧性耐氧 芽孢梭菌屬（Clostridium） 5接觸酶陽性 6 接觸酶陰性，在無糖和乙族維生素的培養(yǎng)基上不生長 16 6細胞總是球狀 7 細胞并非總是球狀 9 7細胞排列成八個球菌的立方體 八疊球菌屬（Sarcina）,（三）、鑒定的工作原則 保證鑒定的分離物是純培養(yǎng) 根據(jù)掌握的材料將分離物由一個大的歸屬范圍逐步縮小到較小的或特殊的類群。 根據(jù)所得到的信息，進一步縮小分離物的歸屬范圍到屬、種 在鑒定中要有一個適當?shù)姆诸悊卧臉藴示曜鰧φ铡?（四）、鑒定的步驟 如果

34、是球形細胞，需觀察只培養(yǎng)幾小時的形態(tài)，看是否有桿狀細胞。如果沒有桿菌，則表明該菌的確為球菌，則根據(jù)革蘭氏反應(yīng)、細胞排列、對糖的利用及產(chǎn)物繼續(xù)鑒定，如有桿狀細胞，則可能是節(jié)桿菌或不動細菌等屬的細菌 如是桿菌，則檢查是否是芽孢菌或者分枝桿菌 如是革蘭氏陽性無芽孢桿菌，應(yīng)檢查是否產(chǎn)乳酸，從而確定是否為乳酸菌。,4如不是乳酸菌，觀察不同培養(yǎng)時間的菌體形態(tài)變化，區(qū)分棒桿菌屬、節(jié)桿菌屬、庫特氏菌屬以及放線菌中的諾卡氏菌屬、假諾卡氏菌屬和嗜皮菌屬。 5如是革蘭氏陰性桿菌，則檢查對葡萄糖氧化發(fā)酵作用和氧化酶反應(yīng)。配合鞭毛染色即可大致區(qū)分該菌株屬于哪個屬,（五）.微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù) 1、微量多項試

35、驗鑒定系統(tǒng)（簡易診檢技術(shù)，數(shù)碼分類鑒定法） 針對微生物的生理生化特征，配制各種培養(yǎng)基、反應(yīng)底 物、試劑等，分別微量(約0.1ml)加入各個分隔室中(或用小圓 紙片吸收)，冷凍干燥脫水或不干燥脫水，各分隔室在同一塑 料條或板上構(gòu)成檢測卡。試驗時加入待檢測的某一種菌液，培 養(yǎng)2-48小時，觀察鑒定卡上各項反應(yīng)，按判定表判定試驗結(jié) 果，用此結(jié)果編碼，查檢索表(根據(jù)數(shù)碼分類鑒定的原理編制 成)，得到鑒定結(jié)果，或?qū)⒕幋a輸入計算機，用根據(jù)數(shù)碼分類 鑒定原理編制的軟件鑒定，打印出結(jié)果。,1、 API 細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) 2、 Enterotube 系統(tǒng) 3、 Biolog 全自動或手動細菌鑒定系統(tǒng) 4、國產(chǎn)：

36、眾多,1、 API 細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng),菌種,基本培養(yǎng)基 （液體）,菌懸液,檢測、編碼、查表、鑒定,適用于API鑒定細菌有700多種,API鑒定系統(tǒng)的組成: 試劑條(板)、添加試劑及檢索工具配套形成的完整的微生物鑒定系統(tǒng)。,API系統(tǒng)為一塊塑料板，上有20個小杯，每個小杯裝有不同的生化反應(yīng)培養(yǎng)基和指示劑。 API系統(tǒng)包括鑒定腸道菌的API-20E；鑒定厭氧菌的API-20A等。 另外，又出現(xiàn)了一種API50的研究裝置，包括50個小杯，是API20E的補充裝置，以鑒定API20E不能鑒定的菌株。,API鑒定系統(tǒng)的操作 (一)接種物的準備 1標本經(jīng)分離培養(yǎng)得到純菌落。 2涂片、染色鏡檢、氧化酶等試驗

37、對被測菌進行初步鑒定，以選擇合適的試劑條。 3挑取1個至數(shù)個菌落，按不同試劑條的要求用蒸餾水或生理鹽水制備菌懸液，菌懸液的濃度按不同試劑條的要求調(diào)整至0.5麥氏單位或1.5麥氏單位濃度。 (二)試劑條的準備 1準備培養(yǎng)盒(包括底座和蓋子)，加約5ml蒸餾水于底座內(nèi)，以保持一定的濕度； 2在盒上標明菌株的編號、來源、患病史等材料。 3包裝中取出試劑條，放入培養(yǎng)盒中。,(三)試劑條的接種 1在測定名稱下無任何標記者例ADH、LDC等，菌懸液加至小管滿而小杯空。 2在測定名稱下面劃線者例0DC、MNE等，菌懸液只加滿管部分，然后再小杯內(nèi)覆蓋著液狀石蠟。 3在測定名稱劃有缺邊框者例|CLU|、|ARA

38、|等，應(yīng)將菌懸液充滿管和小杯二部分。,(四)觀察和解釋結(jié)果 接種后的APl試劑條一般經(jīng)35孵育1824h可觀察結(jié)果。 1有的可直接讀，產(chǎn)酸試驗可根據(jù)指示劑的變色，記錄陽性或陰性，同化試驗可根據(jù)接種物有無生長，記錄陽性或陰性。 2有的測定必需加不同試劑后，記錄陽性或陰性。 3結(jié)果與每份說明書附有的鑒定表比較，可直接得到鑒定物的菌名。 4將結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)碼，得到一數(shù)碼圖圖譜，查對“分析圖譜索引手冊”，可得菌名、id、評價和補充編碼表號等。 5也可將結(jié)果輸入計算機給予鑒定。 (五)質(zhì)控 可參照各說明書上給予的菌株進行，并對照表中所列的結(jié)果核對，如完全一致，說明試劑條質(zhì)量完好，所得結(jié)果可靠無誤。如不一致

39、，測定結(jié)果有待查改。,2、Enterotube 系統(tǒng),不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同步接種，培養(yǎng)后檢測、查表、鑒定。,Enterotube系統(tǒng)是用無菌的互相間隔開的塑料管組成一個整體，其中八個小室，分別裝有不同酶作用物和指示劑，每個塑料管兩端各有一個帽蓋并封存一只接種針，接種時除去接種針外端的帽蓋，并用該針從原始培養(yǎng)平皿上挑取菌落，然后伸入進塑料管中，將菌種接種到培養(yǎng)基上，再將針體部分抽出，拆掉留在管外的部分。遺留在管內(nèi)的部分針體有助于保持厭氧條件，接種針抽出部分則可提供給需氧條件。蓋上帽蓋，將接種管孵育過夜。,3、Biolog全自動或手動細菌鑒定系統(tǒng),在96孔的細菌培養(yǎng)板上檢測微生物對不同發(fā)酵

40、性碳源利用情況進行的分類鑒定。,自動化、快速,可鑒定細菌有1140多種、酵母菌267種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。,每個孔中含有不同的底物,菌懸液或無菌水,Biolog公司獨創(chuàng)的碳源利用方法，利用微生物對不同碳源代謝率的差異，針對每一類微生物篩選95種不同碳源，配合四唑類顯色物質(zhì)(如TTC、TV)，固定于96孔板上(A1孔為陰性對照)，接種菌懸液后培養(yǎng)一定時間，通過檢測微生物細胞利用不同碳源進行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化(吸光度)以及由于微生物生長造成的濁度差異(濁度)，與標準菌株數(shù)據(jù)庫進行比對，即可得出最終鑒定結(jié)果。,主要特點： 快速讀取結(jié)果： 強大的數(shù)據(jù)

41、庫 智能軟件 操作簡單 微生物群落分析和生態(tài)研究功能,鑒定步驟如下： 第一步;用Biolog專用培養(yǎng)基將純種擴大培養(yǎng)。 第二步：按要求配制一定濁度(細胞濃度)的菌懸液。 第三步：將菌懸液接種至微孔鑒定板(Microplate)，培養(yǎng)一定時間。 第四步：將培養(yǎng)后的鑒定板放入讀數(shù)儀中讀數(shù)，軟件自動給出鑒定結(jié)果。,(六). 數(shù)值分類法： 將計算機應(yīng)用于微生物分類中，通過廣泛 比較分類單位的性狀特征，然后計算它們之間 的相似性，再根據(jù)相似性的數(shù)值劃分類群的一 種分類方法。,1）. 數(shù)值分類步驟： 確定分類單位和選擇分類特征。數(shù)值分類最低等級的分類單位稱操作 分類單位(OUT, operational taxonomic unit)，OTU可以是菌株， 也可以是種或?qū)俚取?OTU確定后即選擇分類特征，數(shù)值