1、第2講 酶母細(xì)胞的固定化【重難點(diǎn)突破】一、如何理解固定化酶的作用和原理？1酶的催化活性依賴于酶的空間結(jié)構(gòu)及活性中心。所以在固定化要選擇適當(dāng)條件，力圖不使其活性中心的基團(tuán)受到影響。2酶固定化的方法很多，目前采用的固定化技術(shù)大致可分為三類：載體結(jié)合法(包括共價鍵結(jié)合法、離子結(jié)合法、物理吸附法)、交聯(lián)法和包埋法。上述幾種方法也可并用，稱為混合法。(1)載體結(jié)合法：利用共價鍵、離子鍵和物理吸附法把酶固定在纖維素、瓊脂糖、多孔玻璃和離子交換樹脂等載體的固定化處。 (2)交聯(lián)法：交聯(lián)法是利用雙功能試劑的作用，在酶分子之間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而制成的固定化酶。酶蛋白中的游離基團(tuán)(如氨基、巰基等)可參與交

2、聯(lián)反應(yīng)。(3)包埋法：包埋法是將酶包埋在聚合物凝膠的微細(xì)網(wǎng)絡(luò)中或被半透性的聚合物膜所包圍，使酶分子不能從凝膠的網(wǎng)絡(luò)中或膜中漏出，而小分子的底物和產(chǎn)物則可以自由通過凝膠網(wǎng)格和半透膜。3固定化酶應(yīng)用實(shí)例將葡萄糖異化酶固定在果顆狀載體上放入底部有許多小孔的反應(yīng)柱(酶顆粒不能通過，反應(yīng)液能通過)葡萄糖溶液從反應(yīng)柱上端注入流經(jīng)反應(yīng)柱與葡萄糖異構(gòu)酶接觸果糖從反應(yīng)柱下端流出。4.對固定化酶的理解：可以使反應(yīng)過程管道化、自動化，產(chǎn)物易從反應(yīng)液中回收；酶的穩(wěn)定性有所改進(jìn)；酶的使用效率提高?！镜漕}演示1】1. (2010蘇南四市一模)固定化酶是從20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的一種技術(shù)?？蒲腥藛T用海藻酸鈉作為包埋劑

3、來固定小麥酯酶，以研究固定化酶的相關(guān)性質(zhì)和最佳固定條件。酶活力為固定化酶催化化學(xué)反應(yīng)的總效率，包括酶活性和酶的數(shù)量。下圖甲、乙、丙為部分研究結(jié)果。下列有關(guān)敘述中，錯誤的是A由甲圖可知，固定化酯酶比游離酯酶對溫度變化適應(yīng)性更強(qiáng)B由乙圖可知，濃度為3%的海藻酸鈉包埋效果最好C由丙圖可知，固定化酯酶一般可重復(fù)使用3次，之后若繼續(xù)使用則酶活力明顯下降D固定化酶的酶活力較高，主要原因是增加了酶與底物的接觸面積【答案】D【解析】正確掌握固定酶的特性和識別圖形是突破口。甲圖可以看出在50度時游離酶的活性已經(jīng)很低，但是固定酶的活性依然很高，可以判定固定酶的溫度適應(yīng)范圍廣；乙圖反應(yīng)的時海藻酸鈉的濃度與酶活力的關(guān)

4、系，可以看出濃度為3%時，酶活力最高；丙圖可以看出使用三次以后酶活力明顯下降；固定化酶與底物的基礎(chǔ)面積減少?！咀兪接?xùn)練1】1. 下列不屬于固定化酶在利用時的特點(diǎn)的是 （ ） A有利于酶與產(chǎn)物分離 B可以被反復(fù)利用 C能自由出入依附的載體 D一種固定化酶一般情況下不能催化一系列酶促反應(yīng)【答案】C【解析】掌握固定酶的知識時突破口。固定酶是把酶固定在特殊材料上，不能自由出入依附的載體?！咀兪接?xùn)練2】（09江蘇高考生物）下列關(guān)于固定化酶和固定化細(xì)胞的敘述，正確的是（ ）A固定化細(xì)胞技術(shù)在多步連續(xù)催化反應(yīng)方面優(yōu)勢明顯B固定化酶的應(yīng)用中，要控制好pH、溫度和溶解氧C利用固定化酶降解水體中有機(jī)磷農(nóng)藥，需提供

5、適宜的營養(yǎng)條件D利用固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，糖類的作用只是作為反應(yīng)底物【答案】A【解析】本題對固定化酶和固定化細(xì)胞進(jìn)行發(fā)散考查，固定化酶發(fā)揮作用，與溶解氧無關(guān)，B選項(xiàng)錯；固定化酶不屬于生物，不需要提供營養(yǎng)，而固定化細(xì)胞進(jìn)行生命活動，是需要營養(yǎng)的，C選項(xiàng)錯；糖類既是酵母菌作用的底物，也是微生物培養(yǎng)所需碳源?！咀兪接?xùn)練3】、下列有關(guān)固定化技術(shù)的敘述，正確的是（ ）A固定化酶只是在細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用 B固定化酶能提高酶的利用率C酶的固定是酶分離純化的常用方法 D固定化酶的固定化方式就是吸附在固體表面上?！敬鸢浮緽【解析】本題主要考查固定化酶的相關(guān)知識?？季V中的能力要求是A級。理解固定化技術(shù)的原理及優(yōu)

6、點(diǎn)是本題的解題突破口。制成固定化酶的步驟是：酶的生產(chǎn)、提取、酶的分離純化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固體表面，有將酶相互連接起來將酶包埋在細(xì)微的網(wǎng)格里等；這樣的固定化酶能重復(fù)利用，從而提高了酶的利用率；而酶在條件適宜時，既可在細(xì)胞內(nèi)起作用，也能在細(xì)胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在細(xì)胞外發(fā)揮作用。二 如何理解固定化細(xì)胞的作用和原理？1、固定化微生物細(xì)胞利用微生物來生產(chǎn)酶，具有生產(chǎn)成本低、周期短、產(chǎn)量大等優(yōu)點(diǎn)。微生物產(chǎn)生的酶，可以分為分泌在細(xì)胞外的胞外酶和包含在細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)酶。利用胞內(nèi)酶時，需要采用手段將細(xì)胞破碎后，將酶進(jìn)行分離純化，提取后酶的活性和穩(wěn)定性往往都受到很大的影響。將

7、微生物細(xì)胞限制或定位于特定空間位置，即將微生物制成固定化細(xì)胞后，既能避免復(fù)雜的細(xì)胞破碎、酶的提取和純化過程，又能使酶的活性和穩(wěn)定性得到較大提高。固定后的微生物細(xì)胞可以作為固體催化劑在多步酶促反應(yīng)中發(fā)揮連續(xù)催化作用，同時，催化反應(yīng)結(jié)束后又能被回收和重復(fù)利用。優(yōu)點(diǎn)：制備容易、酶的活性高且穩(wěn)定。2、固定化活細(xì)胞的制備主要方法：包埋法。將微生物細(xì)胞用物理方法包埋多微也載體內(nèi)部。凝膠包埋是最常用的方法，凝膠種類有瓊脂、海藻酸鈉（鈣）、角叉菜聚糖、明膠和聚丙烯酰胺凝膠。目前常用海藻酸鈣包埋法，其基本原理是：先將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中(常用CaCl2溶液)，使海

8、藻酸鈉中Na+的部分被Ca2+所取代而形成由多價離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。這種方法操作簡便，條件溫和，對細(xì)胞無毒性，適合于生長細(xì)胞的固定化。但磷酸鹽會使凝膠結(jié)構(gòu)破壞，在使用時應(yīng)控制好培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度，并要在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 3、比較直接使用酶、固定化酶和固定化細(xì)胞催化的優(yōu)缺點(diǎn)。類型優(yōu)點(diǎn)不足直接使用酶催化效率高，低耗能，低污染對環(huán)境非常敏感，易失活；難回收，不能再次利用，與產(chǎn)物混在一起，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量固定化酶(1)極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。(2)可以在較長時間內(nèi)反復(fù)使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。(3)酶反

9、應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于工藝自動化和微電腦化。(4)在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。(5)較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。(6)酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。(1)酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。(2)比較適應(yīng)水溶性底物和小分子底物。(3)與完整細(xì)胞比較，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)，同時對胞內(nèi)酶需經(jīng)分離后，才能固定化。 （4）一種酶只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)實(shí)踐中，很多產(chǎn)物的形成是通過一系列的酶促反應(yīng)得到的。固定化細(xì)胞(1)省去了酶的分離手續(xù)為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。(2)細(xì)胞生長快、而且多、反應(yīng)快。(3)可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)

10、約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細(xì)胞，能一邊徘出發(fā)酵液，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。(4)保持酶在細(xì)胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。(2)必須防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性止副產(chǎn)物的形成。(3)細(xì)胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴(kuò)散?！镜漕}演示2】 1. 下列說法不正確的是 （ ） A葡萄糖與固定化葡萄糖異構(gòu)酶接觸，轉(zhuǎn)化成的是果糖 B從固定化酶反應(yīng)柱下端流出的是果糖 C高果糖漿不會像蔗糖那樣誘發(fā)肥胖、糖尿病、齲齒和心血管疾病 D酶溶解于葡萄糖溶液后，可從糖漿中回收【答

11、案】D【解析】正確區(qū)別固定化酶與酶制劑是關(guān)鍵。葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖；在反應(yīng)柱上方流進(jìn)葡萄糖溶液，下方流出果糖；果糖和蔗糖相比較具有很多優(yōu)點(diǎn)；酶不會溶解在反應(yīng)液中，因?yàn)樗还潭ㄔ谳d體材料中。【變式訓(xùn)練4】 1.關(guān)于固定化酶和一般酶制劑在應(yīng)用效果上的說法錯誤的是 ( )A固定化酶生產(chǎn)活性強(qiáng)，可長久使用B一般酶制應(yīng)用后和產(chǎn)物混在一起，產(chǎn)物的純度不高C一般酶制劑參加反應(yīng)后不能重復(fù)利用 D固定化酶可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)量和質(zhì)量【答案】A【解析】區(qū)分固定化酶與酶制劑是本題的解題突破口。該題主要考查了固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，即應(yīng)用后易與產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量；可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。但是

12、固定化酶作為生物催化劑，具有一定的生物活性。隨著時間的推移，酶的活性會降低，甚至消失，即固定化酶不能長久使用。例如：生產(chǎn)高果糖漿的固定化酶一般只能連續(xù)使用半年?！咀兪接?xùn)練5】試分析下圖中，哪一種與用海藻酸鈉作載體制備的固定化酵母細(xì)胞相似（ ） 【答案】D。【解析】本題主要考查酶固定和細(xì)胞固定的相關(guān)知識。考綱中的能力要求是A級。區(qū)分酶固定和細(xì)胞固定的方法是本題的解題突破口。解析過程：A是吸附法，常用于將酶固定；B是載體結(jié)合法多用于酶的固定；C和D是包埋法，C一般是將酶包埋在微網(wǎng)絡(luò)里，D是包埋在凝膠中。制備固定化酵母用的是包埋法，即將酵母菌包埋在海藻酸鈉制成的凝膠中，所以與D相似。三 制備固定化酵

13、母細(xì)胞并進(jìn)行酒精發(fā)酵1.制備固定化酵母細(xì)胞流程2.制備固定化酵母細(xì)胞主要操作過程（1）酵母細(xì)胞的活化。在缺水的狀態(tài)下，微生物會處于休眠狀態(tài)?；罨褪亲屘幱谛菝郀顟B(tài)的微生物重新恢復(fù)正常的生活狀態(tài)。酵母細(xì)胞所需要的活化時間較短，一般需要O51 h，要提前做好準(zhǔn)備。此外，酵母細(xì)胞活化時體積會變大，因此活化前應(yīng)該選擇體積足夠大的容器，以避免酵母細(xì)胞的活化液溢出容器外。（2）海藻酸鈉溶液的配制和使用：對海藻酸鈉溶化時要用小火或間斷加熱，避免海藻酸鈉發(fā)生焦糊；溶化后先冷卻至室溫，再與酵母細(xì)胞混合，避免高溫殺死酵母細(xì)胞；固定化酵母細(xì)胞時，應(yīng)將海藻酸鈉酵母細(xì)胞的混合液用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是

14、注射。海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細(xì)胞的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細(xì)胞的數(shù)目少影響實(shí)驗(yàn)效果。（3）CaCl2的作用是使海藻酸鈉膠體發(fā)生聚沉，形成凝膠珠。剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。（4）凝膠珠的檢測：穩(wěn)定30min以后，一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實(shí)驗(yàn)桌上用手?jǐn)D壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠制作成功。二是在實(shí)驗(yàn)桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的?！镜漕}演示3】1（2010江蘇）右圖1表示制備固定化酵母細(xì)胞的有關(guān)操作，圖2是利用固定化酵母細(xì)胞進(jìn)

15、行酒精發(fā)酵的示意圖。下列敘述正確的是 A剛?cè)芑暮Ｔ逅徕c應(yīng)迅速與活化的酵母菌混合制備混合液 B圖1中X溶液為CaCl2溶液，其作用是使海藻酸鈉形成凝膠珠 C圖2發(fā)酵過程中攪拌的目的是為了使培養(yǎng)液與酵母菌充分接觸 D圖1中制備的凝膠珠用蒸餾水洗滌后再轉(zhuǎn)移到圖2裝置中【答案】BCD【解析】正確掌握準(zhǔn)備固定酵母細(xì)胞的方法和意義是關(guān)鍵。搞清固定過程所涉及的材料，明確酒精發(fā)酵的流程及操作意義?！咀兪接?xùn)練6】 1、（09屆鹽城市摸底）下列有關(guān)固定化酵母細(xì)胞制備步驟正確的是 ( )A應(yīng)使干酵母與自來水混合并攪拌，以利于酵母菌活化 B配制海藻酸鈉溶液時要用小火間斷加熱的方法C向剛?cè)芑玫暮Ｔ逅徕c溶液中加入已活

16、化的酵母細(xì)胞，充分?jǐn)嚢璨⒒旌暇鶆駾將與酵母細(xì)胞混勻的海藻酸鈉液注入CaCl2溶液中，會觀察到CaCl2溶液中有球形或橢珠形的凝膠形成 【答案】B?！窘馕觥勘绢}主要考查固定化酵母細(xì)胞的相關(guān)知識?？季V中的能力要求是B級。掌握固定化酵母細(xì)胞的方法和步驟是本題的解題突破口。解析過程：由于在缺水狀態(tài)下，微生物處于休眠狀態(tài)，為了加速酵母細(xì)胞的活化，將干酵母與蒸餾水混合后應(yīng)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。為避免海藻酸鈉發(fā)生焦糊，溶化時要小火間斷加熱。如果將剛?cè)芑玫暮Ｔ逅徕c與已活化的酵母細(xì)胞混合，有可能會殺死酵母細(xì)胞。將與酵母細(xì)胞混勻的海藻酸鈉用注射器緩慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注入?！咀兪接?xùn)練7】.（2009通州

17、調(diào)研）固定化酶是從20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的一種技術(shù)。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研人員利用雙重固定法，即采用戊二醛作交聯(lián)劑（使酶相互連接），海藻酸鈉作為包埋劑來固定小麥酯酶，研究固定化酶的性質(zhì)，并對其最佳固定條件進(jìn)行了探究。下圖顯示的是部分研究結(jié)果（注：酶活力為固定化酶催化化學(xué)反應(yīng)的總效率，包括酶活性和酶的數(shù)量），分析回答：（1）從對溫度變化適應(yīng)性和應(yīng)用范圍的角度分析，甲圖所示結(jié)果可以得出的結(jié)論是_。（2）乙圖曲線表明濃度為_的海藻酸鈉包埋效果最好，當(dāng)海藻酸鈉濃度較低時，酶活力較低原因是_。（3）固定化酶的活力隨使用次數(shù)的增多而下降，由丁圖可知，固定化酯酶一般可重復(fù)使用_次，酶活力明顯下降。（4）固定

18、小麥酯酶不采用海藻酸鈉直接包埋，同時用戊二醛作交聯(lián)劑，這是因?yàn)開?！敬鸢浮浚?）固定化酯酶比游離酯酶對溫度變化適應(yīng)性更強(qiáng)且應(yīng)用范圍較廣 （2）3% 海藻酸鈉濃度較低時包埋不緊密，酶分子容易漏出，數(shù)量不足 （3）3 （4）酶分子很小，很容易從包埋材料中漏出【解析】理解利用固定化酶的制作、工作原理、優(yōu)缺點(diǎn)是解決本題的突破口。固定化酶應(yīng)用后易與產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量；可以反復(fù)利用，降低生產(chǎn)成本。但是固定化酶作為生物催化劑，具有一定的生物活性。隨著時間的推移，酶的活性會降低，甚至消失，即固定化酶不能長久使用?！緜溆谩?.（09江蘇卷）酶解法制備原生質(zhì)體的原理是利用酶溶液對細(xì)胞壁成分的降解作用。蝸牛酶液從蝸牛（以植物為食）消化腺中提??；果膠酶、纖維素酶從微生物中提取。為了研究不同酶液的酶解效果，某實(shí)驗(yàn)小組取無菌煙草幼葉，切成相同大小的小片，等量放入6支試管中，試劑用量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于下表。請回答有關(guān)問題。 試管編號項(xiàng)目IV蒸餾水（mL）2O1111緩沖液（mL）0210.50.50.5果膠酶液（mL）O0O0.5O0蝸牛酶液（mL）O0OO0.50纖維素酶液（mL）0O0O00.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果（綠色深淺程度）+（注：“+”越多表示綠色越深，“一”表示顏色無顯著變化）（1）實(shí)驗(yàn)過程中，需要輕搖試管，其目的是 ，使原