1、第十三章,可見分光光度法和紫外分光光度法,1.光的性質(zhì)及物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收(了解) 2. 分光光度法的基本原理, Lambert-Beer 定律及有關(guān)計(jì)算(掌握) 3. 分光光度計(jì)的基本構(gòu)造, 熟悉標(biāo)準(zhǔn)曲線法(了解) 4. 提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法(了解) 5. 紫外分光光光法的一般概念(了解),本章內(nèi)容,分光光度法的基本原理及Lambert-Beer 定律 可見分光光光法的測(cè)量方法。,-重點(diǎn),分光光度法,（spectrophotometry),定義：根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種方法,原理： 吸收光譜 物質(zhì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部特征,定量分析：確定某一成份或某一化合

2、物存在多少,定性分析：確定某一成份某一化合物是否存在,分光光度法的分類,光源波長(zhǎng)范圍( nm) 類型,380780 可見分光光度法,200380 紫外分光光度法,7803105 紅外分光光度法,分光光度法特點(diǎn)：, 靈敏度高: 10-510-6mol/L最低濃度, 準(zhǔn)確度較高, 操作簡(jiǎn)便、快速, 應(yīng)用廣泛,分光光度法的應(yīng)用,例：阿司匹林（乙酰水楊酸）片劑中水楊酸的鑒別,阿司匹林易吸收空氣中的水份而水解產(chǎn)生水楊酸，而水楊酸容易刺激胃。國(guó)家藥監(jiān)局規(guī)定：水楊酸的含量 0.1,紫外分光光度法，在max=312nm 處進(jìn)行測(cè)定,例2： 紫外分光光度法廣泛用于生物試樣中蛋白質(zhì)（max=280 nm ），核酸

3、的純度分析（max=260 nm ）,例3： 食品(果醬、果汁、肉制品)中苯甲酸鹽、山梨酸鹽含量的測(cè)定,山梨酸鹽等常用作食品添加劑以抑制酵母和霉菌的生長(zhǎng),食品工業(yè)上對(duì)其用量一般有嚴(yán)格限定(如：果醬 0.1 ),苯甲酸鹽的石油醚溶液(max=225 nm )處有最大吸收峰；山梨酸鹽的石油醚溶（max=250nm ）處有最大吸收峰。,第一節(jié) 物質(zhì)的吸收光譜,1、光的基本性質(zhì) 光是一種電磁波，具有波 粒二象性。 光的波長(zhǎng)（）、頻率（）與速度（c）的關(guān)系如下：,E=h=h c/ c 波長(zhǎng)短，能量大，穿透力強(qiáng)；波長(zhǎng)長(zhǎng)，能量小，穿透力弱。,一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,2. 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收,物質(zhì)對(duì)光的吸

4、收具有選擇性,例：石英 可見光 幾乎不吸收,光學(xué)：物質(zhì)對(duì)光的吸收是物質(zhì)的普遍性質(zhì),紅外光 強(qiáng)烈吸收,物質(zhì)對(duì)光的吸收是物質(zhì)(分子、原子、離子等)與輻射能相互作用的一種形式，只有當(dāng)入射光的能量同吸光物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差相等時(shí)才會(huì)被吸收,物質(zhì)對(duì)光的吸收： E = 光子能量(h),M (基態(tài)) + h M (激發(fā)態(tài)),2. 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收, 物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色與光有著密切的關(guān)系，不同波長(zhǎng)的可見光可使眼睛感覺到不同的顏色。,可見光,各種顏色光有波長(zhǎng)范圍,紫外,紫,藍(lán),青,綠,黃,橙,紅,紅外,400,450,480,500,560,600,650,760,800nm,3.物質(zhì)顏色與吸收光的關(guān)系,單

5、色光：具有單一波長(zhǎng)的光,復(fù)合光：由不同波長(zhǎng)光組成的光,白光（日光、白熾燈光等）：由不同顏色的 光按一定強(qiáng)度比例混合而成,互補(bǔ)色光：兩種顏色的光按適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比例混合可成白光，則這兩種光互稱為,三個(gè)概念,物質(zhì)對(duì)光的吸收有選擇性,溶液對(duì) 各種色光,不吸收,全吸收, 溶液的顏色 溶液選擇吸收了某種顏色的光，則溶液呈現(xiàn)吸收光的互補(bǔ)色光的顏色,無色透明,黑色,圖示： CuSO4溶液呈藍(lán)色,復(fù)合光 黃色光被吸收 溶液呈藍(lán)色 硫酸銅溶液,紅,橙,黃,綠,青,青藍(lán),藍(lán),紫,對(duì)角上的顏色 稱為互補(bǔ)色光,物質(zhì)的顏色與 吸收光顏色為 互補(bǔ)色光, 物質(zhì)顏色與吸收光顏色的關(guān)系,白光,物質(zhì)的顏色和其吸收光顏色的關(guān)系,物質(zhì)的

6、顏色,吸收光,顏色,黃綠,黃,橙,紅,紫紅,紫,藍(lán),綠藍(lán),藍(lán)綠,黃綠,黃,橙,紅,紫,藍(lán),綠藍(lán),藍(lán)綠,綠,/nm,400450 450480 480490 490500 500560 560580 580600 600650 650760,吸收光譜(吸收曲線) ( absorption spectrum),圖12-3 不同波長(zhǎng)KMnO4溶液吸收光譜, 當(dāng)濃度改變時(shí),max位置不變 (525nm),物質(zhì)種類 max A C,0.2,0.4,0.6,0.8,400,450,500 波長(zhǎng),550,600,650,20mgL 40mgL 60mgL,nm,A,二、物質(zhì)的吸收光譜,？,定性分析：由于不同

7、物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，因此，吸 收的紫外光波長(zhǎng)也不同，利用這一 性質(zhì)可以鑒別物質(zhì)。 定量測(cè)定：同一物質(zhì)的稀溶液，濃度大的吸光度 的值較大，反之則較小，利用這一性 質(zhì)可進(jìn)行定量測(cè)定。,max是定性分析的依據(jù) A 是定量分析的依據(jù),第二節(jié) 分光光度法基本原理,一、透光率和吸光度,圖13-3 光通過溶液的情況,I0,It,b,I0 = Ia + It + Ir,I0 = Ia + It,T ItI0,T:透光度(transmittance) 或百分透光率( T%),A:吸光度 (absorbance) A= -lgT = lgI0It,二、朗伯-比爾定律（光吸收定律） Lambert-Beer定律,I0,I

8、t,b,Lambert定律：A= k1b,A=bc,Beer定律： A= k2c Lambert-Beer定律：,T= 10-bc,A= -lgT,圖13-3 光通過溶液的情況,公式適用范圍, 單色光 均勻溶液(稀溶液) 氣相、均相固體 可見光區(qū)，紫外、紅外區(qū),式中b的單位cm c為物質(zhì)的量濃度，單位為mol L-1 稱為摩爾吸光系數(shù) 單位: L mol-1cm-1,A = -lgT = -lg It /I0 =bc,若用質(zhì)量濃度(g L-1)代替物質(zhì)的量濃度c，則,A = a b,a為質(zhì)量吸光系數(shù) 單位 L . g-1.cm-1, = a MB,A = bc, (a)：衡量吸光光度法的靈敏度

9、, 是有色物質(zhì)的特征常數(shù), (或 a )值說明：,. . . .,與c、b無關(guān),與,入射光波長(zhǎng),物質(zhì)本性,溶劑，溫度,有關(guān);,測(cè)定時(shí)，取max，值最大,顯色反應(yīng)最靈敏（104105）,測(cè)定使用的值，如不特別注明，通常指在max條件下測(cè)定的,化合物組成不明，物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量( M )不知道，物質(zhì)的量的濃度無法確定，無法使用摩爾吸光系數(shù)(),醫(yī)學(xué)上常用比吸光系數(shù),符號(hào)：,比吸光系數(shù)（specific absorptivity),E1%表示,單位：mLg-1.cm-1,與關(guān)系：,時(shí)的吸光值,濃度: 1%(gmL-1) b: 1cm,1cm,E1% = 10,1cm,MB,與 a關(guān)系：a = 0.1

10、,E1%,1cm,三、吸收度的加和性,內(nèi)容： 多組分體系中(a,b,c, )，在某一波長(zhǎng)()，如果各種對(duì)光有吸收的物質(zhì)之間沒有相互作用，則體系在該波長(zhǎng)的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。,表示式： A總Aa + Ab + Ac +,分光光度法中分析測(cè)定混合物中各組分的依據(jù),意義 ?,四、相關(guān)計(jì)算,1. A = -lgT = -lg It /I0 = bc,2. a ,= a MB,例1：已知Fe2+ ：500gL-1 b：2 cm A：0.19 (508nm）,求?,解：,c(Fe2+) =,= 8.910-6molL-1,A=bc,50010-6,55.85,bc,=1.11

11、04 (Lmol-1cm-1),= 0.19 / (28.910-6),例13-1：教材P252 已知某化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmolL-1的溶液，在480nm波長(zhǎng)處用2.00cm吸收池測(cè)得透光率為39.8 ，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)和質(zhì)量吸光系數(shù)a ？,bc,解:已知 c0.150 10-3molL-1,b2.00cm，T0.398,代入公式:,= lg 0.398 (1.50 10-4molL-12.00cm ),a =M, = 1.33 103 L mol -1 cm -1,據(jù)公式:,= 1.33 103 251,= 5.30

12、 L g-1 cm-1,例13-1：教材P252 已知某化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmolL-1的溶液，在480nm波長(zhǎng)處用2.00cm吸收池測(cè)得透光率為39.8 ，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)和質(zhì)量吸光系數(shù)a ？,小結(jié)：,2. Lambert-Beer定律,A = -lgT = -lg It /I0 = bc,三個(gè)吸光系數(shù)：,a,1.物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收,第三節(jié) 可見分光光度法 (spectrophotometry), 原理和特點(diǎn),原理：根據(jù)Lambert-Beers law,白光單色光有色溶液 A值求被測(cè)物含量,一、分光光度計(jì)( spec

13、trophotometer),主要部件,1、光源：鎢絲燈（3203200nm） 穩(wěn)定，足夠光強(qiáng)度,2、單色器：獲取單色光 棱鏡或光柵,3、吸收池：比色皿（石英、玻璃）,4、 檢測(cè)器： 光電管,5、訊號(hào)處理及顯示器：指針式微安表,圖13-4 (b) 混合光在棱鏡中的色散,600,600,2、單色器,準(zhǔn)直鏡,棱鏡,出光狹縫 入光狹縫,白光入光狹縫準(zhǔn)直鏡棱鏡或光柵 色散后的光準(zhǔn)直鏡出光狹縫,轉(zhuǎn)動(dòng)棱鏡或光柵 出光狹縫處獲單色光,圖13-4 (a) 單色器示意圖,2、單色器,4、檢測(cè)器 ：光電管,兩極間加電壓，線路中產(chǎn)生電流,光電流大小與照射光強(qiáng)度成正比,光電管工作線路示意圖,入射光,放大器,記錄器,+,-,陽(yáng)極,陰極(光敏材料如氧化銫),高電阻,5、指示器,圖13-5 吸光度與透光率標(biāo)尺,-721型分光光度計(jì)采用指針式的微安表-,A的刻度不均等 ?,配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,顯色,分別測(cè)定其A值（max）,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)A待測(cè)(條件同上),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求c待測(cè),A,二、 測(cè)定方法,（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線法,選擇適宜的空白溶液（參比溶液）,用空白（參比）溶液調(diào)節(jié)透光度為100%, 消除吸收池壁及溶劑對(duì)入射光反射 和吸收帶來的誤差,（二）標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法,cx=,Ax,As, cs,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 cs,測(cè)As,同條件下測(cè)被測(cè)