1、重點(diǎn)： 固定化技術(shù)的作用和意義，固定化方法，固定化酶的特性與應(yīng)用，固定化細(xì)胞的特點(diǎn)與應(yīng)用，固定化原生質(zhì)體的特點(diǎn)與應(yīng)用。,三、固定化酶特點(diǎn)： 1、不溶于水:反應(yīng)完成后，經(jīng)過(guò)濾或離心等簡(jiǎn)單分離，就可以回收，以重復(fù)使用，降低酶制劑成本。 2、具有一定的機(jī)械強(qiáng)度: 可將其裝成酶柱，當(dāng)?shù)孜锶芤壕従徚鹘?jīng)酶柱時(shí)，就能發(fā)生酶促反應(yīng)，流出液中含有酶促反應(yīng)產(chǎn)物，其產(chǎn)物不易帶雜質(zhì)，收率高，易精制。 3、穩(wěn)定性提高:一根酶柱往往可以連續(xù)使用數(shù)十次，而酶活力并無(wú)明顯下降。, 隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)固定化菌體 。1973年，日本首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中的天門(mén)冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門(mén)冬氨酸。

2、在固定化酶和固定化菌體的基礎(chǔ)上，70年代后期出現(xiàn)了固定化細(xì)胞技術(shù)。 1976年，法國(guó)首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶，開(kāi)始了用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶的先例。 1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸，取得進(jìn)展。固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁的障礙，更有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，這為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線的變革提供了新的方向。,發(fā)展現(xiàn)狀 從目前的發(fā)展?fàn)顩r來(lái)看，盡管酶種類繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對(duì)有限，采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素?；傅仁畮讉€(gè)酶種，故仍需大力研究開(kāi)發(fā)使更多的固

3、定化酶和細(xì)胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。,二、酶和菌體固定化方法 酶和菌體固定化方法很多，主要有 1.吸附法 2.包埋法 3.結(jié)合法 4.交聯(lián)法 5.熱處理法,c. 混和振搖裝載法 (mixing or shaking bath loading) ： 是實(shí)驗(yàn)室常用方法，載體與酶液混和后，要在攪拌下或搖床連續(xù)振搖下完成固定化。該法固定化較為均勻，要注意攪拌或振搖速率，既不破壞酶和載體結(jié)構(gòu)，又要達(dá)到充分混和目的。 d. 反應(yīng)器裝載法(reactor loading process)： 這是工業(yè)上常用方法，它將固定化和其后的應(yīng)用連在一起，即先將載體裝于反應(yīng)器中，再加上酶液，然后通過(guò)循環(huán)流振動(dòng)方式使酶和載體

4、達(dá)到充分混和。,相分離法： 利用高聚物在水相和有機(jī)相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而將酶包埋于中。 例： 以火棉膠（硝化纖維素）包埋酶時(shí)，先將酶的水溶液在含有硝化纖維素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝化纖維素在酶液滴周圍凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉膠囊。,界面聚合法： 利用在微滴的界面通過(guò)縮合反應(yīng)形成水不溶性多聚體制成微囊包埋酶。 例：以尼龍膜包埋酶時(shí)，將酶液及親水性單體（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，將疏水性單體（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等與水不相混溶的有機(jī)溶劑中。然后，將這兩種互不相溶的液體混和在一起。加入乳化劑乳化，使酶液分散成小

5、液滴。此時(shí)，親水性的已二胺與疏水性的癸二酰氯就在二相界面上聚合成半透膜，將酶包埋在小球內(nèi)。再加Tween20，使乳化破壞，用離心分離即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。,表面活性劑乳化液膜法： 在酶的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達(dá)到包埋的目的。該法不含化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性。,c. 脂質(zhì)體包埋： 將酶包埋于脂質(zhì)體(Liposome)中的方法。脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體。 脂質(zhì)體包埋的特點(diǎn)： 具有一定的機(jī)械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應(yīng)用方面受到重視。,2013/10/29,包埋法

6、操作簡(jiǎn)單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶對(duì)大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都可適用。 但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對(duì)大分子底物不適宜。同時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)對(duì)物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)的變化、活力降低。,3、結(jié)合法 選擇適宜的載體，使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法。,根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為： 離子鍵結(jié)合法： 共價(jià)鍵結(jié)合法：,制備方法： 在一定PH、溫度、離子強(qiáng)度等條件下，將酶液與載體混和攪拌幾個(gè)小時(shí)，或?qū)⒚敢壕徛鬟^(guò)處理好的離子交換柱，使酶結(jié)合于離子交換劑上而制得。 特點(diǎn)： 活力損失小，但由于離子鍵結(jié)合力弱，酶

7、與載體之間結(jié)合不牢固，在PH，離子強(qiáng)度等條件改變時(shí)，酶易脫離。, 重氮法： 這是帶芳香氨基載體的主要反應(yīng)，即載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，然后在溫和的條件下和酶分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥基、咪唑基或氨基直接進(jìn)行偶聯(lián)。（見(jiàn)示意圖）, 疊氮法： 此反應(yīng)適用于含羥基、羧甲基等的載體，如CM纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯順丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲基纖維素為例，可先在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，這種產(chǎn)物能在低溫、pH 7.58.5的條件下和酶的氨基直接偶聯(lián)。, 溴化氰法： 帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖凝膠等常用的反應(yīng)。在堿性條件下載體羥基和溴化氰反應(yīng)生成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶

8、的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)（見(jiàn)示意圖）, 烷基化法： 含羥基的載體，堿性條件下可用三氯-均三嗪等反應(yīng)，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。 （見(jiàn)示意圖）,共價(jià)結(jié)合法特點(diǎn)： 結(jié)合很牢固，酶不會(huì)脫落，可以連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間。但載體活化的操作復(fù)雜，同時(shí)由于共價(jià)結(jié)合時(shí)可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性 共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)中的保護(hù)措施： 化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)一般比較激烈，為了減少酶在偶聯(lián)過(guò)程中失效，應(yīng)采取如下保護(hù)措施：, 選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體。 例如：采用重氮法時(shí)要注意載體的親水性與疏水性； 嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，提高反應(yīng)的專一性。 應(yīng)用可逆抑制劑或底物，封閉酶的活性中心與必需基團(tuán)，避免試劑

9、影響酶的活性構(gòu)型和相應(yīng)基團(tuán)。 例如：在進(jìn)行腺苷三磷酸酶 (ATPase)固定化時(shí)，可先用對(duì)羥汞苯甲酸(PHMB)將酶的活性巰基保護(hù)起來(lái)，然后通過(guò)疊氮反應(yīng)將酶偶聯(lián)于羧甲基纖維素上，在完成固定化以后，再用還原劑使-SH活化，這樣可得到高活性的固定化酶。,酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián) （a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶 （b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶,5. 熱處理法： 將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。 熱處理法只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在加熱處理時(shí)，要嚴(yán)格控制好加熱

10、溫度和時(shí)間，以免引起酶的變性失活。 例如：將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌細(xì)胞在6065的溫度下處理15min，葡萄糖異構(gòu)酶全部固定在菌體內(nèi)。,三、固定化酶的性質(zhì) 酶分子經(jīng)固相化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)。酶分子處在一個(gè)與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會(huì)影響酶原有的性質(zhì)。如微環(huán)境的化學(xué)組成，與酶相結(jié)合的表面結(jié)構(gòu)，底物進(jìn)入與底物排出微環(huán)境的速度，微環(huán)境的局部pH等。 現(xiàn)將固定化酶的一些主要性質(zhì)介紹如下：,1. 穩(wěn)定性： 固相酶的穩(wěn)定性比游離酶高，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。 （1）熱穩(wěn)定性： 固定化酶熱穩(wěn)定性較之天然酶提高。如氨基酸?；?（見(jiàn)示意圖）,(2) 對(duì)蛋白酶水解作用穩(wěn)定性： 固

11、相酶比天然酶有更強(qiáng)的抵抗蛋白酶水解作用的能力。（見(jiàn)示意圖）,(3) 對(duì)變性試劑作用的穩(wěn)定性： 固相酶對(duì)各種蛋白變性劑的穩(wěn)定性，一般都比天然酶強(qiáng)。（見(jiàn)示意圖）,(4) 保藏穩(wěn)定性： 固相酶比天然酶保存的時(shí)間更長(zhǎng)。 如：天然胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4保存4個(gè)月，殘留活力僅為原活力的2%。偶聯(lián)于瓊脂糖后，在同樣條件下，卻可保存82%的活力，因此固相酶有利于運(yùn)輸、貯存和重復(fù)使用。,2. 最適溫度： (1) 固相酶的最適溫度一般比天然酶高 例如：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高510； 以共價(jià)結(jié)合法固定化的色氨酸酶，其最適溫度比游離酶高515。,(2) 同種酶，采

12、用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同 如：氨基?；?用DEAE葡聚糖凝膠經(jīng)離子鍵結(jié)合法固定化后，其最適溫度(72)比游離酶的最適溫度(60)提高12； 用DEAE纖維素固定化，其最適溫度(67)比游離酶提高7； 用烷基化法固定化的氨基?；福渥钸m溫度卻比游離酶則有所降低。,四、固定化酶的應(yīng)用 1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用： 現(xiàn)已用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶主要有： (1) 氨基?；福?這是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過(guò)離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用來(lái)拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生

13、產(chǎn)L-氨基酸；生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60左右。,(2) 葡萄糖異構(gòu)酶 這是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞用6065熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。此固定化酶在國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行過(guò)廣泛的研究和應(yīng)用，1973年就已用于工業(yè)化生產(chǎn)。 固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備，除用上述熱處理法外，也可用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法、交聯(lián)法或雙重固定化法等進(jìn)行固定化。,(3) 天門(mén)冬氨酸酶 1973年日本用聚丙烯酰胺凝膠為載體，將具有高活力天冬氨酸酶的大腸桿菌菌體包埋制成固定化天冬氨酸酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬氨酸。

14、1978年以后，改用角叉菜膠為載體制備固定化酶，也可將天冬氨酸酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來(lái)，再用離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。,(4) 青霉素?；福?這是在醫(yī)藥工業(yè)上廣泛應(yīng)用的一種固定化酶?？捎枚喾N方法固定化。1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造各種半合成青霉素和頭孢霉素。用同一種固定化青霉素酰化酶，只要改變pH等條件，既可以催化青霉素或頭孢霉素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA)，也可以催化6-APA或7-ACA與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)，以合成新的具有不同側(cè)鍵基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素。 其他用于工業(yè)生產(chǎn)中的固定化酶見(jiàn)下表,2、固定化酶在傳感

15、器方面的應(yīng)用 （1）酶?jìng)鞲衅魇怯晒潭ɑ概c傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成的不溶于水的固定化酶膜。 最常用的酶?jìng)鞲衅魇敲鸽姌O，即將固定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當(dāng)酶膜 與被測(cè)物發(fā)生催化反應(yīng)而生成電極活性物質(zhì)后，電極測(cè)定活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn) 換為電信號(hào)輸出。已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過(guò)程控制和環(huán)境監(jiān)測(cè)等 領(lǐng)域。其中研究最多、應(yīng)用最廣的是酶電極。,一些常見(jiàn)的酶電極,第三節(jié) 微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞固定化 一、基本概念 二、細(xì)胞固定化方法 三、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用 四、固定化植物細(xì)胞 五、固定化動(dòng)物細(xì)胞,2013/11/4,一、基本概念 通過(guò)各種方法，將細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合，制備

16、固定化細(xì)胞的過(guò)程，稱為細(xì)胞固定化。 固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞，稱為固定化細(xì)胞，固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，故又稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞都可制成固定化細(xì)胞。,二、細(xì)胞固定化方法 主要有吸附法、包埋法、直接固定法。 1、吸附法 (1) 基本概念：利用各種固體吸附劑，將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。 (2) 常用吸附劑：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等。,三、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用 1、利用固定化微生物細(xì)胞生產(chǎn)各種產(chǎn)物： 固定化微生物細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)，繁殖和薪陳代謝，所以利用固定化

17、細(xì)胞可以如同游離細(xì)胞那樣發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝物。由于微生物固定化后，受載體的影響，故固定化微生物只用于生產(chǎn)各種能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物。 其中主要有下面幾類物質(zhì)：,2、固定化微生物細(xì)胞制造微生物傳感器： 微生物傳感器是由固定化微生物細(xì)胞與各種能量轉(zhuǎn)換器(電極，燃料電池，場(chǎng)效應(yīng)管等)密切結(jié)合而成的傳感裝置。 微生物傳感器分為呼吸活性測(cè)定型和電極活性測(cè)定性兩種。,呼吸活性測(cè)定型：利用固定在高分子膜上的微生物細(xì)胞的呼吸作用，測(cè)定氧 氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測(cè)定物質(zhì)的量。由固定化微生物膜和 氧電極或二氧化碳電極結(jié)合而成。,電極活性測(cè)定型：利用固定在膜上的微生物細(xì)胞的新陳代謝作用，測(cè)定電極活 性物

18、質(zhì)的量的變化，來(lái)確定樣品中預(yù)測(cè)物質(zhì)的含量，由固定化微生物膜與生物燃 料電池、離子選擇電極和氣體電極等組成。 微生物傳感器巳成功用于測(cè)定葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、谷氨酸、氨、 硝酸鹽、生化需氧量(BOD)、細(xì)胞數(shù)量等。,四、固定化植物細(xì)胞 1、固定化植物細(xì)胞特點(diǎn) (1) 植物細(xì)胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護(hù)作用，可減輕剪切力和其他外界因素對(duì)植物細(xì)胞的影響提高植物細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性。 (2) 細(xì)胞經(jīng)固定化后，被約束在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)，不容易聚集成團(tuán)。,(3) 固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡(jiǎn)便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，即首先在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)增殖，在達(dá)到一定的細(xì)胞密度后，改換

19、成發(fā)酵培養(yǎng)基，以利于生產(chǎn)各種所需的次級(jí)代謝物。 (4) 固定化植物細(xì)胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)的一段時(shí)間，從而縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率。 (5) 固定化植物細(xì)胞易與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。,2、動(dòng)物細(xì)胞固定化方法：主要為吸附法與包埋法 (1) 吸附法：大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中，必須趨向于附著在固體表面吸附法特別適合于動(dòng)物細(xì)胞的固定化。 此法操作簡(jiǎn)便、條件溫和，是動(dòng)物細(xì)胞固定化中最早研究和使用的方法。 常用的吸附固定化載體有： 轉(zhuǎn)瓶 微載體 中空纖維,a. 轉(zhuǎn)瓶吸附： 轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，表面經(jīng)過(guò)一定方法處理而帶上電荷。如用高錳酸鉀等氧化劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿

20、或紫外光照射等進(jìn)行表面處理，就可使動(dòng)物細(xì)胞容易附著在其表面生長(zhǎng)。 培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)瓶以一定的速度轉(zhuǎn)動(dòng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，但比表面積(SV，表面積與體積之比值)較小，細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖受到限制。若在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)加進(jìn)列管或多層平板組成列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶即可使其比表面積增加，從而提高生產(chǎn)能力。,b. 微載體吸附： 微載體是指顆粒細(xì)小的固定化載體直徑一般為100200m，相對(duì)密度接近l.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠，纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。 微載體巳用于多種動(dòng)物細(xì)胞的固定化；用于生產(chǎn)-干擾素，人組織纖溶酶原活化劑、白細(xì)胞介素以及各種疫苗等。 微載體具有很大的比表面積，S

21、/V達(dá)到150，即每1cm3的微載體其表面積達(dá)到150cm3，比轉(zhuǎn)瓶的比表面積大幾百倍，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和物質(zhì)傳遞非常有利。缺點(diǎn)是固定化細(xì)胞的強(qiáng)度不夠，容易破碎，使用時(shí)間較短。,一、概述 1、基本概念：將微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞去細(xì)胞壁后，可得原生質(zhì)體，將此原生質(zhì)體用多孔凝膠包埋，即為固定化原生質(zhì)體。 2、固定化細(xì)胞的缺陷 (1) 只能用于生產(chǎn)胞外酶和其它能夠分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物。 (2) 由于載體的影響，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物擴(kuò)散受到一定限制。 3、固定化原生質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)： (1) 促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)分泌到胞外。 (2) 有利于氧的傳遞，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。,二、原生質(zhì)體制備 1. 制備原則： (1) 既要破壞細(xì)胞 ，又

22、不能影響到細(xì)胞膜的完整性。 (2) 不能使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞。 2. 制備方法： 主要使用對(duì)細(xì)胞壁有專一性作用的酶。其制備過(guò)程為： (1) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞收集起來(lái)，懸浮于含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中。 (2) 加入適宜的細(xì)胞壁水解酶，在一定條件下作用一段時(shí)間，使細(xì)胞壁破壞。 (3) 分離除去細(xì)胞壁碎片、未作用細(xì)胞、及胞壁水解酶，從而得原生質(zhì)體。,四、固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用 固定化原生質(zhì)體一方面保持了細(xì)胞原有的新陳代謝特性，可以照常產(chǎn)生原來(lái)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，另一方面又去除了細(xì)胞壁這一擴(kuò)散屏障，有利于胞內(nèi)產(chǎn)物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎和提取工藝而在發(fā)酵液中獲得所需的

23、發(fā)酵產(chǎn)物，為胞內(nèi)物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)辟了新途徑。固定化原生質(zhì)體可用于各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)的生產(chǎn)以及甾體轉(zhuǎn)化等。,文獻(xiàn)：固定化酶和固定化細(xì)胞工業(yè)應(yīng)用的現(xiàn)狀與展望 （上海市工業(yè)微生物研究所） 用固定化酶代替水溶性酶用于工業(yè)生產(chǎn), 具有很多優(yōu)點(diǎn): (l) 可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng), 降低酶的成本; (2) 易將酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi), 簡(jiǎn)化提純工藝; (3 ) 提高酶的穩(wěn)定性, 并可改變酶的特性, 使之更適合工業(yè)生產(chǎn)的需要; (4 ) 增加產(chǎn)品的收率, 提高產(chǎn)品的質(zhì)量; (5 ) 便于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的連續(xù)化和自動(dòng)控制, 節(jié)省勞動(dòng)力。,固定化細(xì)胞更具有一些新的優(yōu)點(diǎn)： (l) 不需要將酶從微生物細(xì)胞中提取出來(lái)并加以純化, 因而酶的活力損失小, 成本低; (2 ) 酶處于細(xì)胞天然環(huán)境中,更加穩(wěn)定; (3 ) 與游離細(xì)胞相比, 可以長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用, 降低成本; (4 ) 與固定化酶相比, 更適合于進(jìn)行多酶順序連續(xù)反應(yīng); (5 ) 與固定化酶相比, 更易于進(jìn)行輔助因子的再生, 因而更適合于需要輔助因子的反應(yīng), 如氧化還原反應(yīng)、合成反應(yīng)等。,人們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中, 充分發(fā)揮了固定化酶和固定化細(xì)胞在簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝和降低成本方面的巨大潛力, 收到了很好的效果。人們常稱之為“長(zhǎng)效的酶” 、“無(wú)公害新型催化劑”等。目前固定化酶和固定化細(xì)胞己經(jīng)應(yīng)用在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析、親和層析、環(huán)境保護(hù)、能源