1、sanger測序-基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn),曹尚志,sanger測序原理,Sanger測序的基本流程,測序結(jié)果的分析,雙脫氧末端終止法,引物設(shè)計 實驗流程 上機測序,怎樣分析結(jié)果 問題峰圖分析,ddNTP被加到正在合成的鏈上，由于它的3-OH已被氧化，下一個dNTP的5-磷酸基團不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。 在引物等延伸反應(yīng)過程中，ddNTP在不同位置摻入，產(chǎn)生了一系列不同長度的新的DNA片段。,5,3,5,3,一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法,一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法,二、Sanger測序的實驗基本流程（以MTHFR(RS1801133)檢測為例）,1.根據(jù)rs號得到

2、位點信息及目標(biāo)序列,2.引物設(shè)計,3.測序PCR模板的制備,4. 測序樣品的制備,5.上機測序,1.根據(jù)rs號得到位點信息及目標(biāo)序列,+,2.1 primer primer 5.0,2.引物設(shè)計,2.2 引物特異性檢查,2.引物設(shè)計,避免3端錯配,Your Text Here,避免熒光標(biāo)記,測序引物長度16-25bp，TM值50-65為宜,55最佳,測序引物位置避免Poly（A.T）和高GC結(jié)構(gòu),測序引物位置距離位點最多600bp，至少50bp,不能使用兼并引物測序,引物純度（PAGE純化方式）,2.3 設(shè)計引物還需注意,3.測序PCR模板的制備,根據(jù)合成回來的引物濃度稀釋，一般工作液10um

3、ol/ul(4保存)，母液100umol/ul（-20保存）,1.PCR擴增三步法：變性-退火-延伸 2.退火溫度：(Ftm+Rtm)/2-5 3.延伸時間：1kb=1min,根據(jù)設(shè)計好的參數(shù)，設(shè)置使用PCR儀器擴增.,3.1 PCR擴增,稀釋引物,設(shè)計方案,pcr儀擴增,依賴于 PCR反應(yīng)的優(yōu)化程 PCR產(chǎn)物的質(zhì)量 選擇最佳的純化方法,純化的意義,純化（試劑盒） 方式選擇,1.柱純化：用于特異PCR產(chǎn)物純化或存在100bp的非特異產(chǎn)物的純化 (如：引物二聚體) 2.切膠回收：可用于任何質(zhì)量的PCR產(chǎn)物純化切下條帶，去除非特異PCR產(chǎn)物和引物二聚體,3.2 PCR產(chǎn)物純化,去除PCR反應(yīng)液的殘

4、留,1.殘留的引物：保證引物特異性，避免多重測序 2.殘留的dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs的最佳比例 3.鹽成分：避免抑制測序酶活性 4.非特異PCR產(chǎn)物：避免擴增出同源性區(qū)域,測序PCR,酒精/EDTA/NaAc法：去除殘留的BigDye Terminator(染料峰) 測序產(chǎn)物脫鹽 純化好的測序產(chǎn)物比較穩(wěn)定,測序產(chǎn)物純化,4.測序樣品制備,測序PCR（以回收PCR產(chǎn)物為模板）：96 1 min -(96 10 sec - 50 5 sec - 60 4 min) x 25循環(huán)-4 保溫,測序PCR與普通PCR的區(qū)別,5. 上機測序,pcr擴增儀器中95變性4min。.,5.1

5、 測序樣品變性,5.2 上機操作,三、 測序結(jié)果分析,怎樣看測序結(jié)果,怎樣得到位點基因型,常見峰圖介紹,保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性,峰圖判斷三要素：電泳圖(Electropherogram)、峰圖(Raw)、QV值,峰圖,電泳圖/QV值,1.怎么看峰圖（分析軟件Sequence Analysis）,Raw：峰圖,Electropherogram：電泳圖,QV值 QV值越高，讀圖越準(zhǔn)確。 QV值為藍(lán)色，表示可信。 QV值為黃色，表示不準(zhǔn)確，需要人工判讀。 QV值為紅色，表示不可信,QV值,根據(jù)得到位點信息，將位點3保守序列（10個堿基左右），在軟件中Chromas查找，前面即為突變基因型。 PS:如果

6、是反向引物測序需要將測序結(jié)果反向互補,2.怎樣得到位點基因型（分析軟件Chromas）,正常及無信號、信號弱測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,正常峰圖（有完整峰型、單一峰尖銳獨立、QV值基本上為藍(lán)色),Electropherogram：,Raw：,無信號（無完整峰型、無信號或信號值較低、峰圖雜亂無章、絕大部分不可信）,Raw：,Electropherogram：,信號弱（有較完整峰型、信號值較低、峰圖部分可信）,Raw：,Electropherogram：,正常及無信號測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響

7、及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,poly（A、T）結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后雙峰,返回,Electropherogram：,Raw：,測序信號中斷（二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致）,返回,Electropherogram：,Raw：,序列結(jié)構(gòu)高GC導(dǎo)致信號衰減,返回,Electropherogram：,Raw：,正常及無信號測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,峰圖出現(xiàn)斷層（可先重跑看是否解決，需要換Buffer）,Electropherogram（電泳圖、QV正常）,Raw：,毛細(xì)管堵塞導(dǎo)致拖尾（可先重跑看是否解決，或者清理毛細(xì)管）,Electropherogram（展開圖正常）,Raw：,毛細(xì)管堵塞導(dǎo)致寬峰（可先重跑看是否解決，或者清理毛細(xì)管）,Electropherogram：,Raw：,正常及無信號測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,染料峰（純化操作不規(guī)范或者ddntp過量）,返回,Electropherogr