1、第十一章 遺傳的分子基礎(chǔ),第一節(jié) DNA作為主要遺傳物質(zhì)的證據(jù) 第二節(jié) 核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制 *第三節(jié) 遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控 第四節(jié) 基因的概念與發(fā)展 第五節(jié) 基因突變的分子機(jī)制 第六節(jié) 遺傳工程,第一節(jié) DNA作為主要遺傳物質(zhì)的證據(jù),一、 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù) 二、 DNA是遺傳物質(zhì)的直接證據(jù) (一)、 細(xì)菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn) (二)、 噬菌體侵染與繁殖試驗(yàn) (三)、 煙草花葉病毒拆合實(shí)驗(yàn) *三、非核酸類(lèi)的遺傳物質(zhì),一、 DNA是遺傳物質(zhì)的間接證據(jù),1. DNA含量的恒定性； 2. DNA代謝的穩(wěn)定性； 3. 基因突變與紫外線(xiàn)誘變波長(zhǎng)的關(guān)系。,(二)、 噬菌體侵染與繁殖試驗(yàn),1. 背景知識(shí)

2、 噬菌體侵染與繁殖基本過(guò)程： T2噬菌體浸染大腸桿菌后，遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞； 利用大腸桿菌的遺傳復(fù)制系統(tǒng)復(fù)制噬菌體遺傳物質(zhì)； 利用大腸桿菌的遺傳信息表達(dá)系統(tǒng)合成噬菌體組件； 最后組裝形成完整的T2噬菌體。 因此只要弄清侵染時(shí)進(jìn)入細(xì)菌的是噬菌體的哪一部分，就可能證明哪種物質(zhì)是遺傳信息的載體。 另外： P是DNA的組成部分，但不存在于蛋白質(zhì)中； S存在于蛋白質(zhì)中，但DNA中沒(méi)有。,2. Hershey和Chase的實(shí)驗(yàn),結(jié)果與結(jié)論,試驗(yàn)結(jié)果表明： 主要是由于DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才產(chǎn)生完整的噬菌體； 結(jié)論：DNA才是(噬菌體的)遺傳物質(zhì)。 題外話(huà)： 與Avery等人研究比較，本試驗(yàn)的精度低得多。但是由

3、于放射性標(biāo)記法(也稱(chēng)為示蹤原子法)，當(dāng)時(shí)為人們普遍采用； 同時(shí)由于核酸研究及其它相關(guān)的成果，本試驗(yàn)結(jié)果很快得到人們的廣泛認(rèn)同。,(三)、 煙草花葉病毒拆合試驗(yàn),煙草花葉病毒(TMV)是由RNA與蛋白質(zhì)構(gòu)成的管狀微粒： 中心是單鏈螺旋RNA、外部是蛋白質(zhì)外殼。 1. 拆分感染試驗(yàn)： 將TMV的RNA與蛋白質(zhì)分離、提純； 分別接種煙葉，發(fā)現(xiàn)RNA能使煙葉致病，而蛋白質(zhì)不能； 用RNA酶處理RNA后接種煙葉也不能致病，表明RNA可能就是TMV的遺傳物質(zhì)。,2. 重組合試驗(yàn),Frankel-Conrat, Singer (1956)進(jìn)行了圖示試驗(yàn)： 綜上所述：到上世紀(jì)中期，多方面證據(jù)都直接或間接地表明

4、DNA是主要的遺傳物質(zhì)，而在缺乏DNA的某些病毒中RNA就是遺傳物質(zhì)。,第二節(jié) 核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與DNA復(fù)制,*一、早期對(duì)核酸化學(xué)性質(zhì)的研究 二、DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) 三、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) *四、RNA的分子結(jié)構(gòu) *五、DNA的復(fù)制,*一、早期對(duì)核酸化學(xué)性質(zhì)的研究,雖然上世紀(jì)中才認(rèn)識(shí)到DNA的生物學(xué)功能，核酸研究卻已有一百多年歷史： F.Mischer(1869)從外科繃帶上膿細(xì)胞核中分離出一種不同于蛋白質(zhì)的物質(zhì)，含磷量高、并具有很強(qiáng)的酸性。他將這種物質(zhì)稱(chēng)核質(zhì)(素)(nuclein)； A.Kossel(1879)發(fā)現(xiàn)酵母等核質(zhì)具有A、G、T、C四種堿基； R.Altamm(1889)將核素命名為核

5、酸(nucleic acid)。,Kossel(1901)又發(fā)現(xiàn)核酸中具有碳水化合物(糖)； P.A.T.Levene(1909)研究表明：酵母核酸含有五碳糖核糖； Fisher(1914)人工合成核苷酸； P.A.T.Levene(1929)又發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胸腺細(xì)胞核酸含有脫氧核糖. Levene將前者命名為核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)，后者命名為脫氧核糖核酸(deoxy-ribonucleicacid, DNA)。并指出動(dòng)、植物中均存在這兩種核酸。,二、 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu),關(guān)于堿基的種類(lèi)、分子式、核苷酸的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)等內(nèi)容是生物化學(xué)中討論的內(nèi)容，請(qǐng)課后復(fù)習(xí)。 在此談三個(gè)關(guān)于核

6、酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)容： (一)、 “四核苷酸”假說(shuō)； (二)、 查伽夫定則及其意義； *(三)、 核苷酸序列及其測(cè)定。,(一)、 “四核苷酸”假說(shuō),P.A.T.Levene(1930)提出“四核苷酸”假說(shuō)，認(rèn)為： 核苷酸是核酸的基本組成單位； 核酸是“磷酸核糖(堿基)磷酸”的核苷多聚體。 四核苷酸假說(shuō)奠定了核酸化學(xué)基礎(chǔ)。但同時(shí)認(rèn)為： 核酸多聚體是由“四核苷酸結(jié)構(gòu)”重復(fù)形成； 每個(gè)四核苷酸結(jié)構(gòu)包含四種堿基各一個(gè)； 所以事實(shí)上認(rèn)為在任何DNA中，四種堿基是等量的，DNA是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)。 這種觀念影響了人們對(duì)核酸生物學(xué)功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。,(二)、 查伽夫定則及其意義,E.Chargaff于19

7、46-1950年根據(jù)紙層析、離子交換層析和紫外分光光度試驗(yàn)結(jié)果提出查伽夫定則： 四種堿基的數(shù)量不是等量的； 同一物種DNA堿基組成不變，而物種間則有很大不同； 嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量(克分子總量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。,*(三)、 核苷酸序列及其測(cè)定,查伽夫定則表明：核酸并不是四核苷酸結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)，核酸的堿基序列信息可能具有重要意義。 以后的研究表明：堿基序列正是核酸生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，是遺傳信息的內(nèi)在形式。 DNA及RNA分子序列分析技術(shù)也是最重要的分子遺傳學(xué)研究技術(shù)： Sanger雙脫氧法； Maxam&Gillbert化學(xué)法； 基于化學(xué)法的DNA序列自動(dòng)分析儀已

8、成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備。,三、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu),*(一)、DNA分子結(jié)構(gòu)的研究 1. 鮑林研究小組 2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組 3. 沃生、克里克研究小組 (二)、 DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn) 2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義 3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,*(一)、DNA分子結(jié)構(gòu)的研究,在“四核苷酸結(jié)構(gòu)”理論的誤導(dǎo)下，人們普遍認(rèn)為核酸的組成、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可能不具有重要功能，一度忽略了對(duì)核酸的研究。 上世紀(jì)中期，眾多研究表明：核酸是遺傳信息的載體，顯然DNA的結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)一步研究其功能和作用方式的基礎(chǔ)。 也由此激發(fā)了科學(xué)家從事核酸結(jié)構(gòu)研究的興趣，當(dāng)時(shí)進(jìn)行DNA結(jié)

9、構(gòu)研究的科學(xué)家很多，最重要有：,1. 鮑林研究小組,主要工作： 鮑林(Pauling)等1951年(提出蛋白質(zhì)-螺旋模型后)開(kāi)始研究DNA分子結(jié)構(gòu)。 根據(jù)阿斯伯利Astbury等1938年獲得的DNA分子晶體X射線(xiàn)衍射圖像(顯示DNA分子晶體呈螺旋結(jié)構(gòu))進(jìn)行研究。 提出DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入多鏈、螺旋和氫鏈等概念。 評(píng)價(jià)： 雖然他們提出的模型并不正確，但是其研究方向和所采用的方法卻為DNA分子結(jié)構(gòu)模型研究確立了方向。 注：1954年鮑林因研究物質(zhì)聚合力而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組,主要工作成就： Wilkins和Franklin改進(jìn)了DNA分子晶體X射線(xiàn)衍射

10、圖譜技術(shù)； 于1951年獲得了更為清晰的圖像； 結(jié)果表明：堿基位于螺旋內(nèi)側(cè)而磷酸基團(tuán)在外側(cè)，同時(shí)測(cè)得了DNA螺旋的直徑和螺距。,3. 沃生、克里克研究小組,Waston、Crick(1951-1953)： 研究手段非常簡(jiǎn)單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。 理論知識(shí)深厚、富于創(chuàng)造性；視野廣闊、收集信息全面并善于分析利用。,3. 沃生、克里克研究小組,主要基于Chargaff、Pauling和Wilkins等三個(gè)方研究成果，Waston和Crick于1953年提出了他們的第三個(gè)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。 現(xiàn)在人們公認(rèn)這是分子遺傳學(xué)建立的標(biāo)志。 為此Waston，Crick和

11、Wilkins于1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。,1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),瓦特森(Watson, J. D.)和克里克(Crick, F.)模型最主要特點(diǎn)有： (1) 兩條多核苷酸鏈以右手螺旋的形式，彼此以一定的空間距離，平行地環(huán)繞于同一軸上，很象一個(gè)扭曲起來(lái)的梯子(圖)。,1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),(2) 兩條多核苷酸鏈走向?yàn)榉聪蚱叫小＜匆粭l鏈磷酸二脂鍵為53方向，而另一條為35方向，二者剛好相反。亦即一條鏈對(duì)另一條鏈?zhǔn)穷嵉惯^(guò)來(lái)的，這稱(chēng)為反向平行。,1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),(3) 每條長(zhǎng)鏈的內(nèi)側(cè)是扁平的盤(pán)狀堿基，堿基一方面與脫氧核糖相聯(lián)系，另一方面通過(guò)

12、氫鍵(hydrogen bond)與它互補(bǔ)的堿基相聯(lián)系，相互層疊宛如一級(jí)一級(jí)的梯子橫檔?；パa(bǔ)堿基對(duì)A與T之間形成兩對(duì)氫鍵，而C與G之間形成三對(duì)氫鍵,1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn),(4) 上下堿基對(duì)之間的距離為3.4。每個(gè)螺旋為34(3.4nm)長(zhǎng)，剛好含有10個(gè)堿基對(duì)，其直徑約為20。 (5)在雙螺旋分子的表面大溝(major groove)和小溝(minor groove)交替出現(xiàn)。,DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu),堿基配對(duì)及氫鍵形成,2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義,DNA雙螺旋模型結(jié)構(gòu)同時(shí)表明： DNA復(fù)制的明顯方式半保留復(fù)制。Waston和Crick在1953年就指出：D

13、NA可以按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行半保留復(fù)制。而在此之前對(duì)復(fù)制方式人們對(duì)一無(wú)所知。 基因和多肽成線(xiàn)性對(duì)應(yīng)的一個(gè)可能的理由：DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序；DNA中的遺傳信息就是堿基序列；并存在某種遺傳密碼(genetic code)，將核苷酸序列譯成蛋白質(zhì)氨基酸順序。 在其后的幾十年中，科學(xué)家們沿著這兩條途徑前進(jìn)，探明了DNA復(fù)制、遺傳信息表達(dá)與中心法則等內(nèi)容。,3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,近來(lái)發(fā)現(xiàn)DNA的構(gòu)型并不是固定不變的，除主要以瓦特森和克里克提出的右手雙螺旋構(gòu)型存在外，還有許多變型。所以現(xiàn)在一般將瓦特森和克里克提出的雙螺旋構(gòu)型稱(chēng)為BDNA。BDNA是DNA在生理狀態(tài)下的

14、構(gòu)型。生活細(xì)胞中極大多數(shù)DNA以BDNA形式存在。但當(dāng)外界環(huán)境條件發(fā)生變化時(shí)，DNA的構(gòu)型也會(huì)發(fā)生變化。實(shí)際上在生活細(xì)胞內(nèi)，BDNA一螺圈也并不是正好10個(gè)核苷酸對(duì)，而平均一般為10.4對(duì)。,3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,當(dāng)DNA在高鹽濃度下時(shí)，則以ADNA形式存在(圖)。 ADNA是DNA的脫水構(gòu)型，它也是右手螺旋，但每螺圈含有11個(gè)核苷酸對(duì)。ADNA比較短和密，其平均直徑為23。大溝深而窄，小溝寬而淺。在活體內(nèi)DNA并不以A構(gòu)型存在，但細(xì)胞內(nèi)DNARNA或RNARNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，卻與ADNA非常相似。,3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)，某些DNA序列可以以左手螺旋的形式存在，稱(chēng)為Z

15、DNA(圖)。 當(dāng)某些DNA序列富含GC，并且在嘌呤和嘧啶交替出現(xiàn)時(shí)，可形成ZDNA。ZDNA除左手螺旋外，其每個(gè)螺圈含有12個(gè)堿基對(duì)。分子直徑為18，并只有一個(gè)深溝?，F(xiàn)在還不知道，ZDNA在體內(nèi)是否存在。,3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性,*四、RNA的分子結(jié)構(gòu),至于RNA的分子結(jié)構(gòu)，就其化學(xué)組成上看，也是由四種核苷酸組成的多聚體。它與DNA的不同，首先在于以U代替了T，其次是用核糖代替了脫氧核糖，此外，還有一個(gè)重要的不同點(diǎn)，就是絕大部分RNA以單鏈形式存在，但可以折疊起來(lái)形成若干雙鏈區(qū)域。在這些區(qū)域內(nèi)，凡互補(bǔ)的堿基對(duì)間可以形成氫鍵(圖)。但有一些以RNA為遺傳物質(zhì)的動(dòng)物病毒含有雙鏈RNA。,R

16、NA的分子結(jié)構(gòu),*第三節(jié) 遺傳信息的表達(dá)與調(diào)控,一、中心法則及其發(fā)展 二、遺傳信息的轉(zhuǎn)錄(RNA的合成) 與RNA的加工 三、遺傳密碼及其特性 四、遺傳信息的翻譯 五、基因表達(dá)調(diào)控,一、中心法則及其發(fā)展,遺傳信息從DNAmRNA蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程，以及遺傳信息從DNADNA的復(fù)制過(guò)程，這就是分子生物學(xué)的中心法則(central dogma) 中心法則(central dogma)闡述生物世代、個(gè)體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過(guò)程中的信息流向。 最初由Crick提出，并經(jīng)過(guò)了多次修正。,一、中心法則及其發(fā)展,中心法則所闡述的是基因的兩個(gè)基本屬性：復(fù)

17、制與表達(dá)。關(guān)于這兩個(gè)屬性的分子水平的分析，對(duì)深入理解遺傳及變異的實(shí)質(zhì)具有重要的意義。 這一法則被認(rèn)為是從噬菌體到真核生物的整個(gè)生物界共同遵循的規(guī)律。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)RNA可以反轉(zhuǎn)錄成為DNA，RNA還可以自我復(fù)制以及在離體條件下DNA可以直接指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，從而增加了原中心法則的信息流向，豐富了中心法則的內(nèi)容。,一、中心法則及其發(fā)展,中心法則的發(fā)展,反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)： 反轉(zhuǎn)錄酶； cDNA。 RNA的自我復(fù)制。 DNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。,三、遺傳密碼及其特性,遺傳密碼的基本特性： 三聯(lián)性； 非重疊性； 連續(xù)性； 簡(jiǎn)并性； 有序性； 通用性。,三、遺傳密碼及其特性,起始密碼子與終止密碼子： 起

18、始密碼子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)； 終止密碼子(無(wú)義密碼子)：UAA、UAG、UGA。 通用性的另外情況：,第四節(jié) 基因的概念與發(fā)展,一、經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念 二、生化遺傳和早期分子遺傳學(xué) 對(duì)基因概念的發(fā)展 三、基因的微細(xì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 四、現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念,二、 生化遺傳學(xué)對(duì)基因概念的發(fā)展,生化遺傳及早期分子遺傳研究在兩個(gè)重要方面發(fā)展了基因的概念： 基因是DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段，并且在染色體上位置固定、序列連續(xù)；遺傳信息就存在于核苷酸(堿基)序列中。 “一個(gè)基因一個(gè)酶”，基因表達(dá)為蛋白質(zhì)；基因的核苷酸序列決定蛋白質(zhì)氨基酸序列。,三、基因的微細(xì)結(jié)構(gòu)與性

19、質(zhì),(一)、 位置效應(yīng) (二)、 遺傳的最小結(jié)構(gòu)單位 果蠅眼型遺傳與擬等位基因 雙重感染與基因內(nèi)重組 遺傳的最小結(jié)構(gòu)單位 (三)、 遺傳的最小功能單位,(一)、 位置效應(yīng),位置效應(yīng)：基因在染色體上位置不同對(duì)性狀表現(xiàn)的作用(程度)也可能不同。 果蠅16A區(qū)段(Bar基因)重復(fù)處于染色體的不同位置對(duì)其個(gè)體眼面大小(小眼數(shù)目)的效應(yīng)不同。 位置效應(yīng)表明：染色體并非基因的簡(jiǎn)單容納器，基因在染色體上的位置也對(duì)其功能具有重要影響。 所以“念珠理論”的第一點(diǎn)(基因與染色體的關(guān)系)得到了發(fā)展。 “念珠理論”的另一個(gè)內(nèi)容是基因的結(jié)構(gòu)不可分性(最小遺傳結(jié)構(gòu)單位)。不可分性最早遇到的挫折也是來(lái)自對(duì)果蠅的研究。,1.

20、 果蠅眼型遺傳試驗(yàn)(E. B. Lewis),列維斯得到果蠅染色體2末端一個(gè)位點(diǎn)的兩個(gè)突變型： 顯性星眼突變型(S)：雜合體S/+野生型眼稍?。?隱性擬星眼(ast)：純合體ast/ast眼更小。 基因定位發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變?cè)谕粎^(qū)域，且S/ast雜合體眼型最小。 幾種基因型眼型表現(xiàn)為：+/+ S/+ ast/ast S/ast；將四種表現(xiàn)型分別用：A、B、C、D表示。 功能和位置關(guān)系表明S和ast是等位基因。 Lewis得到一個(gè)果蠅品系：S基因兩側(cè)具有al和ho兩個(gè)隱性突變標(biāo)記( al S ho )，并獲得雜種al S ho/+ ast +。,試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果分析與擬等位基因(Psendoallel

21、e),野生型的個(gè)體是如何產(chǎn)生的？ 研究發(fā)現(xiàn)回復(fù)突變頻率很低，不能產(chǎn)生如此高頻率(萬(wàn)分之2.8)的野生型； 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：16個(gè)野生型個(gè)體均表現(xiàn)為+ + ho，表明在al-ho間發(fā)生了交換。 基于基因不可分性(交換只發(fā)生在基因間)，Lewis認(rèn)為： S和ast是兩個(gè)緊密連鎖基因，而不是一對(duì)等位基因； 由于它們功能相似，均控制果蠅的眼型，所以稱(chēng)為擬等位基因(Psendoallele)。 據(jù)此Lewis認(rèn)為野生型產(chǎn)生于擬等位基因S和ast間交換。,圖示與分析,Lewis認(rèn)為突變基因S與擬星眼突變基因ast間是擬等位基因關(guān)系，能解釋果蠅眼型遺傳試驗(yàn)結(jié)果；同時(shí)也能解釋其它研究結(jié)果，如：果蠅菱形眼突變型

22、遺傳。 但擬等位基因并不能直接證明，因?yàn)榧词筍與ast確是擬等位基因，也難以分離它們：表型相似、緊密連鎖。,2. T4突變型(rII)遺傳研究,Seymour Benzer(1955)用E. Coli烈性噬菌體T4突變型遺傳研究證明：擬等位基因的說(shuō)法是不正確的。 T4野生型在E. Coli菌苔上產(chǎn)生小而不規(guī)則噬菌斑。 T4突變品系按表型可分為：rI、rII、rIII三類(lèi)。其中rII在E.Coli B上產(chǎn)生快速溶菌現(xiàn)象，形成大而圓噬菌斑，在E.Coli K()上不能生長(zhǎng)。,試驗(yàn)方法與結(jié)果,試驗(yàn)方法： 最初得到8個(gè)不同的r突變型品系，8個(gè)突變基因均定位于T4DNA的一個(gè)區(qū)段內(nèi)(rII區(qū)段)； 將8

23、種突變型兩兩組合混和感染E. Coli B菌株(雙重感染, double infection)； 從混和培養(yǎng)物中提取噬菌體顆粒感染E. coli K()。 試驗(yàn)結(jié)果： 在菌苔上獲得了許多小而粗糙的野生型噬菌斑。,雙重感染試驗(yàn),野生型的產(chǎn)生與基因內(nèi)重組,結(jié)果分析： 回復(fù)突變的頻率很小，不會(huì)產(chǎn)生如此高頻率的野生型噬菌體(斑)；所以野生型只能由重組產(chǎn)生。 用擬等位基因可以解釋試驗(yàn)結(jié)果；但同時(shí)意味著：rII區(qū)段內(nèi)至少存在8個(gè)擬等位基因。 Benzer先后分離到400多個(gè)不同的rII突變。在rII區(qū)段內(nèi)存在如此多的基因顯然是不可能的。 結(jié)論： 這些基因并不是所謂的擬等位基因，而就是rII區(qū)段突變形成的復(fù)

24、等位基因。 基因是由更小的重組單位構(gòu)成，野生型產(chǎn)生于基因內(nèi)重組，從而推翻了經(jīng)典遺傳學(xué)基因不可分性的性質(zhì)。,*雙重感染法繪制rII區(qū)段連鎖圖,操作方法： 用兩種rII突變型雙重感染B品系，收集溶菌液； 分別接種到B品系、K()品系菌苔上； 考察兩個(gè)品系菌苔上的噬菌斑數(shù)目，就可以計(jì)算兩個(gè)突變位點(diǎn)間的重組值； 重組值=K上的噬菌斑數(shù)目/ B上的噬菌斑數(shù)目 繪制連鎖遺傳圖。 由于采用了條件致死選擇系統(tǒng)(即在E. Coli K()上rII不能生長(zhǎng))，分辨率極高，可以檢測(cè)到十萬(wàn)分之一的重組值。,B品系雙重感染的結(jié)果,3. 最小的結(jié)構(gòu)單位,重組值檢測(cè)精度可達(dá)十萬(wàn)分之一，但實(shí)際結(jié)果不會(huì)低于0.01%；可推斷基

25、因內(nèi)存在最小重組單位，本澤爾將最小重組單位定義為重組子(recon)。 rII區(qū)段存在多種突變的結(jié)構(gòu)表明：基因也并非最小突變單位。Benzer提出用突變子(muton)來(lái)描述基因突變的最小單位。 理論上講突變子不必等于重組子。但以后研究顯示：突變子和重組子都是一個(gè)核苷酸對(duì)或者堿基對(duì)(bp)。所以基因內(nèi)每個(gè)堿基均可能發(fā)生突變，任意兩個(gè)堿基間均能發(fā)生交換重組。,(三)、 遺傳的最小功能單位,1. 雙突變雜合體的互補(bǔ)作用 2.順?lè)礈y(cè)驗(yàn)與順?lè)醋?1. 雙突變雜合體的互補(bǔ)作用,假定有兩個(gè)獨(dú)立起源的隱性突變，具有類(lèi)似的表型，如何判定是屬于同一基因(功能單位)的突變還是分別屬于兩個(gè)基因(功能單位)的突變呢？

26、 在二倍體生物中，可以建立雙突變雜合體。雙突變體雜合體有兩種形式，即順式(cis)和反式(trans)，如圖所示：,2.順?lè)礈y(cè)驗(yàn)與順?lè)醋?根據(jù)兩突變反式雙雜合體有無(wú)互補(bǔ)作用可以判斷它們是否為同一個(gè)功能單位的突變： 突變型無(wú)互補(bǔ)作用為同一功能單位的突變； 野生型有互補(bǔ)作用為不同功能單位的突變。 這種測(cè)驗(yàn)稱(chēng)為互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)，也稱(chēng)為順?lè)礈y(cè)驗(yàn)(cis-trans test)。Benzer將順?lè)礈y(cè)驗(yàn)所確定的最小遺傳功能單位稱(chēng)為順?lè)醋?cistron)，順?lè)醋觾?nèi)發(fā)生的突變間不能互補(bǔ)。,rII順?lè)礈y(cè)驗(yàn),rII區(qū)段突變的性質(zhì)： rII突變具有共同性狀，按經(jīng)典遺傳學(xué)理論，rII區(qū)段為一個(gè)基因； 如果基因是最小的功能單

27、位，它也是一個(gè)順?lè)醋印?Benzer通過(guò)順?lè)礈y(cè)驗(yàn)表明： 100多個(gè)rII突變型可以分為A、B兩組，組間突變型間能夠互補(bǔ)，而組內(nèi)的突變型間不能互補(bǔ)； 與rII區(qū)段連鎖圖對(duì)照發(fā)現(xiàn)：兩組突變分別位于rII區(qū)段的兩端| A | B |。,rII的兩個(gè)順?lè)醋?經(jīng)典遺傳學(xué)意義上的一個(gè)基因(rII區(qū)段)實(shí)際上有兩個(gè)順?lè)醋?功能單位)。 因此基因也很可能不是遺傳的最小功能單位。 有些基因具有一個(gè)順?lè)醋樱行┗蚓哂卸鄠€(gè)順?lè)醋印?在多順?lè)醋忧闆r下，基因是幾個(gè)功能單位的復(fù)合體。 Benzer提出“一個(gè)順?lè)醋右粭l多肽鏈”。,四、 現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念,(一)、 現(xiàn)代基因概念 基因是DNA分子上帶有遺傳信息的

28、特定核苷酸序列區(qū)段。 基因由重組子、突變子序列構(gòu)成的。 重組子是DNA重組的最小可交換單位； 突變子是產(chǎn)生突變的最小單位； 重組子和突變子都是一個(gè)核苷酸對(duì)或堿基對(duì)(bp)。 基因可以包含多個(gè)功能單位(順?lè)醋?。,(二)、 基因的功能類(lèi)型,根據(jù)基因的原初功能可以將基因分為： 1. 編碼蛋白質(zhì)的基因，即有翻譯產(chǎn)物的基因。 如結(jié)構(gòu)蛋白、酶等結(jié)構(gòu)基因和產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)基因。 2. 沒(méi)有翻譯產(chǎn)物，不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因。 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA不翻譯，如編碼tRNA、rRNA。 3. 不轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)段。 如啟動(dòng)基因、操縱基因。啟動(dòng)基因是轉(zhuǎn)錄時(shí)RNA多聚酶與DNA結(jié)合的部位。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與DNA結(jié)

29、合的部位。,(三)、 基因的幾種特殊形式,1. 重復(fù)基因： 指在染色體組上存在多份拷貝的基因。重復(fù)基因往往是生命活動(dòng)中最基本、最重要的功能相關(guān)的基因。 最典型的重復(fù)基因是rRNA、tRNA和組蛋白基因等。 2. 重疊基因： 同一段DNA序列，由于閱讀框架(轉(zhuǎn)錄范圍)不同，同時(shí)成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。 因此基因在染色體上可能有重疊，甚至一個(gè)基因完全存在于另一個(gè)基因內(nèi)部。,3. 斷裂基因或隔裂基因,生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個(gè)連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)。1977年Doel研究表明： 卵清蛋白基因中間存在不表達(dá)的堿基序列，表明基因的DNA序列可能是不連續(xù)的。 外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的DNA

30、片段； 內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的DNA片段。 真核生物基因可能是不同外顯子的組合斷裂基因。,4. 跳躍基因(jumping gene),又稱(chēng)為轉(zhuǎn)座子(transposon)、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子(transposable element)。 生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)還認(rèn)為基因在染色體上的相對(duì)位置是固定的。 后來(lái)發(fā)現(xiàn)某些DNA序列可以在染色體上轉(zhuǎn)變位置。 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位的過(guò)程也是一個(gè)遺傳重組過(guò)程； 轉(zhuǎn)座子在染色體上轉(zhuǎn)位可能會(huì)引起插入位置基因功能喪失(突變)，再次轉(zhuǎn)位離開(kāi)插入點(diǎn)時(shí)便會(huì)發(fā)生基因功能的恢復(fù)。,第五節(jié) 基因突變的分子機(jī)制,一、locus與site 二、基因突變的類(lèi)型 三、DNA的防護(hù)機(jī)制 四

31、、DNA修復(fù)與突變的產(chǎn)生 五、化學(xué)因素誘變的分子機(jī)制,一、locus與site,經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為： 基因是染色體上的一個(gè)點(diǎn)，稱(chēng)位點(diǎn)(site)。 現(xiàn)代基因概念認(rèn)為： 基因是DNA分子帶有遺傳信息的堿基序列區(qū)段； 基因是由眾多堿基對(duì)構(gòu)成，此時(shí)將一個(gè)堿基對(duì)稱(chēng)為基因的一個(gè)位點(diǎn)(site)； 而將基因在染色體上的位置則稱(chēng)為座位(locus)。,二、 基因突變的類(lèi)型,1. 根據(jù)突變所引起的表型改變分為： 形態(tài)突變型； 生化突變型； 致死突變型； 條件致死突變型。 2. 根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的改變方式： 堿基替換突變； 堿基倒位； 移碼(插入與缺失)突變。,二、 基因突變的類(lèi)型,3. 從DNA堿基序列改變的多少：

32、單點(diǎn)突變(替換)；與經(jīng)典遺傳學(xué)的點(diǎn)突變point mutation比較. 多點(diǎn)突變(移碼)。 4. 從突變所引起的遺傳信息意義的改變： 同義突變； 錯(cuò)義突變； 無(wú)義突變。,第六節(jié) 遺傳工程,一、 遺傳工程概述 *二、 染色體工程 *三、 細(xì)胞工程 四、 基因工程,一、 遺傳工程概述,遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質(zhì)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上： 解釋、研究生物進(jìn)化的原因、過(guò)程和規(guī)律(遺傳與進(jìn)化)。 改善動(dòng)、植物和微生物的遺傳特性按照人類(lèi)的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類(lèi)型、新品種的人工進(jìn)化過(guò)程(育種學(xué))。育種工作的理論和技術(shù)水平在很大程度上取決于遺傳學(xué)所取得的成就。 訖

33、今為止，動(dòng)、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細(xì)胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎(chǔ)所取得的。 六、七十年代的綠色革命； 育種工作面臨的問(wèn)題。,一、 遺傳工程概述,(一)、 遺傳工程的基礎(chǔ) 人類(lèi)對(duì)自然改造的能力取決于對(duì)自然規(guī)律的認(rèn)識(shí)水平。分子遺傳、生物化學(xué)及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展使生物遺傳操作的能力正在不斷提高。 遺傳工程的理論與技術(shù)基礎(chǔ)主要來(lái)自于： 1. 分子遺傳學(xué)的理論； 2. 生物化學(xué)及分子生物學(xué)的成就； 3. 細(xì)胞生物學(xué)理論和技術(shù)。,(二)、 遺傳工程的含義,生物技術(shù) 生物工程： 遺傳工程； 蛋白質(zhì)工程、酶工程； 微生物工程； 遺傳工程：在分子遺傳理論、技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)工程

34、設(shè)計(jì)與施工方式，從細(xì)胞、分子水平改造生物遺傳特性。,作為一個(gè)綜合性的技術(shù)群體系，廣義的遺傳工程包含許多相關(guān)的組成部分，其主要的部分有三個(gè)： 1. 染色體工程； 2. 細(xì)胞工程； 3. 基因工程。 狹義的遺傳工程指的是基因工程。,*二、染色體工程,染色體工程是物種間遺傳轉(zhuǎn)移的最傳統(tǒng)的方式，也是目前廣泛進(jìn)入生產(chǎn)應(yīng)用的遺傳工程。 其重要性因作物不同而異： 對(duì)蕃茄而言，世界上任何具有商業(yè)價(jià)值的栽培品種都帶有一個(gè)從野生種導(dǎo)入的抗枯萎病性狀，其它六個(gè)野生種則是耐鹽性、抗蟲(chóng)性等性狀的來(lái)源。 小麥許多抗白粉病基因和抗銹病基因都來(lái)源于其野生近緣物種。 相反，蠶豆改良則完全是在栽培種(Vicia faba)內(nèi)進(jìn)行

35、雜交選擇?，F(xiàn)在還不能從其它任何種導(dǎo)入基因到該作物中。,(一)、 種間有性雜交,生殖隔離是物種形成的原因之一，也是染色體工程面臨的第一個(gè)難題，獲得種間有性雜種的難易直接影響外源基因?qū)朐耘嘧魑铩?對(duì)不同的作物而言，種間雜交障礙的機(jī)制可能截然不同，其表現(xiàn)階段也各不相同。目前認(rèn)為，種間雜交產(chǎn)生雜種的障礙可能表現(xiàn)在以下幾個(gè)階段： 受精前柱頭和花柱中的障礙； 受精過(guò)程中的障礙； 受精后胚與種子發(fā)育過(guò)程中的障礙。,受精前障礙與克服,障礙機(jī)制： 物種間花粉管與雌蕊不親和，在花粉管到達(dá)胚珠之前，停止伸長(zhǎng)而不能受精。 主要克服辦法： 主要是選擇適當(dāng)?shù)氖诜蹠r(shí)期，采用正反雜交、蒙導(dǎo)授粉、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等。 另外，有

36、明確試驗(yàn)證據(jù)表明，栽培物種和野生種內(nèi)均存在可雜交性遺傳變異，并受簡(jiǎn)單遺傳控制。利用可雜交性基因，能提高種間雜交的效率。,受精過(guò)程的障礙與克服,被子植物受精過(guò)程屬于雙受精，對(duì)種間雜交受精過(guò)程的生殖生物學(xué)研究表明：種間雜交的失敗往往是由于雙受精之一失敗引起的。 訖今為止，人們對(duì)受精的控制機(jī)制知之甚少，所以這一領(lǐng)域明顯是一個(gè)有風(fēng)險(xiǎn)，但又極可能富有成效的研究領(lǐng)域。,受精后發(fā)育障礙與克服,受精過(guò)程的障礙機(jī)制： 受精胚珠發(fā)育過(guò)程中也經(jīng)常由于胚、胚乳和母本組織發(fā)育異?；虬l(fā)育不平衡而最終不能產(chǎn)生種間雜種種子。 克服方法： 常用技術(shù)是從生理角度進(jìn)行調(diào)節(jié)，如：采用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或去除母本植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中心。 近年

37、研究表明：提高親本倍性水平，可能有利于胚珠發(fā)育。 通過(guò)離體培養(yǎng)方法可以挽救可能(即將)敗育的雜種胚。一般而言，達(dá)到心形期或以后的胚更易于培養(yǎng)成功。,(二)、雙二倍體的合成,獲得種間雜種不一定就能在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移。物種間的不親和性不僅表現(xiàn)在受精前、受精及受精后各過(guò)程中；親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間雜種往往存在不同程度不育性；因而難以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。事實(shí)上許多種間雜交試驗(yàn)都僅限于獲得雜種F1。 加倍雜種染色體數(shù)目，雙二倍體中親本染色體均成對(duì)存在，可能產(chǎn)生可育配子； 穩(wěn)定雙二倍體可作為新物種直接用于生產(chǎn)。但由于合成雙二倍體往往常有野生種的不利性狀，農(nóng)藝價(jià)值降低。,(三)、 附加、代換、易位,絕大多數(shù)雙二倍

38、體遺傳不穩(wěn)定，只能作為進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)移的新起點(diǎn)和橋梁。在種間雜種及其雙二倍體基礎(chǔ)上，人們?cè)O(shè)計(jì)了許多染色體操作方案，以導(dǎo)入外源目的基因，并盡可能避免導(dǎo)入對(duì)受體有害的遺傳物質(zhì)。理想的情況是只摻入目的基因，而排除外源物種的其它基因。 由于遺傳重組可能性有限，所以導(dǎo)入整條染色體(異附加系、異代換系)是利用外源基因的一種重要方式。 外源染色體上連鎖的不利基因往往極大地限制附加系和異代換系的利用價(jià)值，因而可以采用：輻射、遺傳、單體附加等方式誘導(dǎo)外源染色體與栽培物種染色體易位。,(四)、 染色體工程中的現(xiàn)代技術(shù),在傳統(tǒng)遠(yuǎn)緣雜交的基礎(chǔ)上采用的現(xiàn)代技術(shù)主要是： 離體胚(子房)培養(yǎng)技術(shù)； 植物染色體顯帶技術(shù)； 染色

39、體分子原位雜交技術(shù)等。 染色體工程仍然是外源基因轉(zhuǎn)移最有效、最接近實(shí)際應(yīng)用的技術(shù)。,*三、細(xì)胞工程,細(xì)胞工程的主要技術(shù)和研究領(lǐng)域包括： 細(xì)胞、原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)； 細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生； 體細(xì)胞無(wú)性系變異的誘導(dǎo)、篩選與應(yīng)用； 以細(xì)胞、原生質(zhì)體作為基因工程受體； 細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選、鑒定與應(yīng)用。,(一)、細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生,采用體細(xì)胞雜交在物種間進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)移與應(yīng)用的必要條件是：細(xì)胞、原生質(zhì)體遺傳全能性能充分實(shí)現(xiàn)，再生成新的生物個(gè)體。 對(duì)植物而言，細(xì)胞和原生質(zhì)體再生技術(shù)已經(jīng)比較成熟。 曾經(jīng)是人們公認(rèn)難題的禾本科植物原生質(zhì)體再生在近二十多年來(lái)也已取得巨大進(jìn)展。 對(duì)動(dòng)物而言，克隆

40、羊“多利”的誕生表明：動(dòng)物細(xì)胞(包括人體細(xì)胞)再生成為個(gè)體都具可能，其技術(shù)實(shí)現(xiàn)需要的僅僅是時(shí)間。,(二)、植物原生質(zhì)體作為基因工程的受體,最初常用的轉(zhuǎn)基因受體有葉圓片、幼胚、愈傷組織等植物組織器官。 在這些組織、器官中： 細(xì)胞壁的存在會(huì)增加操作的難度； 產(chǎn)生細(xì)胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選轉(zhuǎn)化子。 因此原生質(zhì)體是最具潛力的植物基因工程受體，轉(zhuǎn)化效率高、篩選方便。,(三)、細(xì)胞、原生質(zhì)體融合,采用細(xì)胞、原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)再生獲得雜種個(gè)體(雙二倍體)，可避免有性雜交障礙。 動(dòng)物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁，細(xì)胞融合技術(shù)較植物成熟和成功。當(dāng)然動(dòng)物細(xì)胞融合都局限于獲得雜種細(xì)胞及其無(wú)性細(xì)胞系。 可以預(yù)見(jiàn)：用

41、雜種細(xì)胞核代替維爾穆特獲得克隆羊所采用的乳腺細(xì)胞核可以獲得物種間雜種生物個(gè)體。 人與小鼠雜種細(xì)胞的無(wú)性細(xì)胞系曾在人類(lèi)基因染色體定位研究上發(fā)揮重要的作用。 植物細(xì)胞融合由于細(xì)胞壁的存在而受到極大的限制。因此，去除細(xì)胞壁分離原生質(zhì)體的技術(shù)是植物細(xì)胞雜交的基礎(chǔ)。獲得雜種細(xì)胞及其再生植株后，即可進(jìn)行物種間細(xì)胞核、染色體以及細(xì)胞器的轉(zhuǎn)移。,四、 基因工程,基因工程是遺傳工程，以至生物工程的核心內(nèi)容和最前沿技術(shù)，最集中地體現(xiàn)了現(xiàn)代生物學(xué)理論和技術(shù)成就。 限制性?xún)?nèi)切酶和載體是基因工程的眾多理論與技術(shù)基礎(chǔ)中最重要的基石。 基因工程的基本步驟可以概括為： 目的基因的獲得(基因克隆)； 目的基因與載體連接(DNA

42、分子重組)； 重組DNA分子導(dǎo)入受體； 轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定。,限制性?xún)?nèi)切酶與DNA連接酶,細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)特異性降解外源(異源)核酸分子的核酸酶。其作用特點(diǎn)是： 特異性降解異源DNA分子(甲基化修飾差異)； I類(lèi)限制酶隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，II類(lèi)限制酶識(shí)別、切割特殊的回文(對(duì)稱(chēng))序列； II類(lèi)限制酶交錯(cuò)切割DNA雙鏈，產(chǎn)生粘性單鏈末端。 來(lái)源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA連接酶的作用下可準(zhǔn)確連接形成重組DNA分子。 通常使用來(lái)自T4噬菌體DNA連接酶。 重組DNA技術(shù)是基因工程最核心的技術(shù)，貫穿于整個(gè)基因工程各個(gè)步驟中。,載體(vector),用于承載、克隆、轉(zhuǎn)移目的基因(DNA片段)，

43、能自我復(fù)制的DNA分子。 在基因克隆時(shí)：將目的片段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制克隆克隆載體； 在基因?qū)胧荏w時(shí)：將目的片段轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中并使之表達(dá)轉(zhuǎn)化載體或表達(dá)載體。,常用基因工程載體有： 細(xì)菌質(zhì)粒(克隆)； 噬菌體(克隆)； 柯斯質(zhì)粒(克隆)； 穿梭質(zhì)粒(克隆/表達(dá))； 細(xì)菌人工染色體(克隆/表達(dá))； 酵母人工染色體(克隆/表達(dá))； Ti質(zhì)粒及其衍生載體(轉(zhuǎn)化)。,(一)、目的基因的獲得,基因工程最主要的特點(diǎn)是其定向性，也就是對(duì)特定的基因進(jìn)行操作。因此分離目的基因并獲得足夠的拷貝數(shù)(基因克隆)是基因工程及相關(guān)研究工作的前提。 1. 基因庫(kù)構(gòu)建與目的基因分離； 2. PCR擴(kuò)增、克隆基因； 3.

44、 化學(xué)法合成基因。 獲得目的基因后可進(jìn)行的研究還包括：序列分析、結(jié)構(gòu)分析、以及表達(dá)機(jī)制研究。,克隆(clone)的含義,名詞(pl. clones)：克隆、無(wú)性(繁殖)系。 生物個(gè)體、細(xì)胞的無(wú)性繁殖系； 同一基因或DNA片段的多份拷貝。 動(dòng)詞(cloning)：克隆。 細(xì)胞克?。簭膯蝹€(gè)細(xì)胞產(chǎn)生一組具有同樣遺傳組成的細(xì)胞； 分子克隆：獲得單個(gè)基因/DNA片段多份拷貝。常用的方法有:將帶有目的片段的重組DNA分子導(dǎo)入到特定宿主細(xì)胞中，利用宿主細(xì)胞DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)制；利用DNA聚合酶在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中復(fù)制(PCR, 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。,基因庫(kù)構(gòu)建與目的基因分離,基因庫(kù)(基因文庫(kù))：包含特定基因組所有基因、DNA區(qū)段的全部分子克隆的集合體。 根據(jù)