1、表觀遺傳學與腫瘤,表觀遺傳學概念,表觀遺傳學是研究不涉及DNA序列變化、可遺傳的基因表達調控方式的學科； 一般來說, 細胞的基因組中除了DNA和RNA序列以外還有很多調控基因表達的信息, 雖然它們本身不會改變基因的序列, 但是可以通過對DNA的修飾、蛋白質與蛋白質、DNA和其他分子間的作用, 影響和調節(jié)基因的功能, 并且通過細胞的分裂和增殖周期影響遺傳, 這些都屬于表觀遺傳學所研究的范疇。,表觀遺傳概念與機制,表觀遺傳是指基因表達或蛋白表達改變不涉及基因DNA序列的變化、但可隨細胞分裂和增殖而穩(wěn)定遺傳的現象。 表觀遺傳機制對于人體多種細胞的生長和分化都是重要的，如X染色體失活等一些正常細胞生理

2、功能都由表觀遺傳所決定。 隨著年齡的增長或環(huán)境的影響，細胞正常的表觀遺傳狀態(tài)可能被打破，從而導致促癌基因的異?；罨蛞职┗虻氖Щ睢⒋龠M腫瘤形成。 表觀遺傳修飾主要包括DNA及一些與DNA密切相關的蛋白質的化學修飾，某些非編碼的RNA也在表觀遺傳修飾中起重要作用；因此表觀遺傳修飾可從DNA、組蛋白、染色質及RNA等多個層面上調控基因的表達。 常見表觀遺傳修飾機制包括：基因組印記、DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA、染色質重塑,一、DNA甲基化與腫瘤,在早期發(fā)育階段，甲基化和非甲基化交替 是細胞得以生長和分化的關鍵程序， 有保證細胞正常發(fā)育和基因組穩(wěn)定性的重要作用 在正常細胞內，啟動子區(qū)的胞

3、嘧啶磷酸鳥嘌呤(CpG)呈非甲基化狀態(tài)，而大多數散在分布的CpG二核苷酸常多發(fā)生甲基化。 DNA甲基化一般與基因的沉默有關，非甲基化則與基因的活化相關，去甲基化往往與沉默基因的重新激活有關。,正常的甲基化對于維持機體的功能是必需的，如基因印記、X染色體失活、細胞分化、胚胎發(fā)育等；而異常的DNA甲基化則會引起疾病甚至腫瘤的發(fā)生，異常CpG的重新甲基化通常被認為是人類癌癥發(fā)生的早期特征 人類腫瘤細胞株中，許多腫瘤相關基因5端啟動子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化，如某些抑癌基因、細胞周期調節(jié)基因、腫瘤轉移抑制基因、DNA修復基因及血管生成抑制基因。有些在不同的癌癥中高甲基化，有些只在特定的癌癥中甲基化； 惡

4、性腫瘤的另一個特點是重復序列如衛(wèi)星DNA和寄生DNA的甲基化程度降低，低甲基化的基因組不穩(wěn)定、易突變； 在許多癌癥中，細胞整體呈現低甲基化水平，并隨著腫瘤進展，低甲基化水平加強；基因整體甲基化水平降低可增加某些基因表達，如ras、myc等原癌基因活化，形成突變熱點、轉座子異常表達、基因不穩(wěn)定等，促進腫瘤發(fā)生,Paz等對人類12種腫瘤70多個腫瘤細胞系進行了15個基因的系統(tǒng)分析： 每種腫瘤至少有1種基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化； 這種啟動子甲基化具有腫瘤類型的特異性； 結直腸癌 DNA錯配修復基因(hMLH1)、O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-MGMT)、金屬蛋白酶組織抑制劑3(TIMP)

5、乳腺癌 僅O6-MGMT基因高甲基化 信號途徑關鍵位置基因異常甲基化可導致該途徑的異常激活或抑制 Wnt途徑中的Wnt抑制因子-1(WIF-1)基因，編碼蛋白與Wnt配體競爭卷曲蛋白受體的結合、阻斷Wnt信號，為該途徑的負反饋調節(jié)基因，該基因的異常高甲基化與鼻咽癌、膀胱癌、食管癌等多種腫瘤的發(fā)生有關,基因的CpG位點是自發(fā)突變的重要位點，人類腫瘤P53基因突變25%發(fā)生于該位點，結直腸癌者達50%,DNA甲基化與早期診斷：可以檢測體液中某些基因的異常甲基化狀態(tài)，為腫瘤的早期診斷。 如檢測肺癌患者痰液中P16甲基化狀態(tài)作為肺癌輔助診斷手段 檢測糞便中分泌型卷曲相關蛋白2基因甲基化狀態(tài)診斷結直腸癌

6、 DNA甲基化與腫瘤發(fā)展及預后 結腸腺瘤性息肉病基因(APC)啟動子甲基化可預示宮頸癌轉移和復發(fā)、并提示患者處于高危狀態(tài) 肝癌細胞鈣粘蛋白基因甲基化與血管浸潤及腫瘤轉移有關 基因異常甲基化還可與染色體缺失協(xié)同抑制基因表達，并且有互作效應,卷曲同系物9(FZD9)基因非甲基化、該位點染色體不發(fā)生缺失的骨髓增生異常綜合征轉化的急性髓系白血病患者 的1年總生存率約為90%；基因甲基化、且該位點染色體不發(fā)生缺失的患者1年總生存率約為75%；基因非甲基化且該位點染色體發(fā)生缺失的患者1年總生存率達40%左右，而基因甲基化、且該位點染色體發(fā)生缺失的患者1年總生存率僅15%左右。,組蛋白修飾與腫瘤,染色質通常

7、由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成，組蛋白是染色質的基本結構蛋白； 組蛋白的N-末端可通過甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化等翻譯后修飾，改變DNA與組蛋白之間的相互作用，影響染色質的松散與集縮，從而激活或抑制轉錄，其中以組蛋白甲基化、乙酰化尤為重要； 組蛋白乙酰化是由組蛋白乙?；D移酶(HAT)和組蛋白去乙?；?HDAC)協(xié)調催化完成； 修飾的部位一般位于N-末端的賴氨酸殘基，如H3上的9號和14號、H4上的5、8、12、16號；,組蛋白乙?；且粋€可逆的動力學過程，可以調節(jié)基因的轉錄； 組蛋白的末端賴氨酸殘基高乙酰化與染色質松散及轉錄激活有關，低乙酰化與基因沉默或抑制有關。組蛋白乙酰

8、基轉移酶催化組蛋白尾部的賴氨酸殘基乙?；瑢е戮植緿NA與組蛋白八聚體的緊密纏繞被解開，使各種轉錄因子能與DNA調控元件相結合，促使基因發(fā)生轉錄； 組蛋白去乙酰化酶異常結合到啟動子區(qū)，從而抑制正常功能基因的轉錄也可能是惡性腫瘤發(fā)生的機制之一,組蛋白甲基化 甲基化位點多位于組蛋白H3、H4的賴氨酸或精氨酸殘基，由組蛋白賴氨酸甲基轉移酶催化 ，而去甲基化由賴氨酸去甲基酶催化； 賴氨酸可單、雙、三甲基化，精氨酸可單、雙甲基化，增加了組蛋白修飾的復雜性 通過組蛋白甲基化的位置，可判斷基因是被激活還是抑制 H3-K9和H4-K20甲基化與基因沉默有關；H3-K4、K36、K79甲基化可使基因激活 組蛋白

9、修飾能夠引起核小體結構的變化, 導致染色質重塑, 影響各類轉錄因子與DNA的結合, 進而影響基因的轉錄。 組蛋白乙?；瘜τ诰S持組蛋白的功能和DNA轉錄是必需的, 組蛋白乙?；氖Ш鈱⒁鹣鄳娜旧w結構和基因轉錄水平的改變，影響細胞周期、分化及凋亡, 并可導致腫瘤的發(fā)生,染色質重塑： 指染色質位置、結構的變化，包括緊縮的染色質絲在與核小體連接處發(fā)生松動，造成染色質的解壓縮，從而暴露基因轉錄啟動子區(qū)中的順式作用元件，為反式作用因子與之結合提供可能。 兩類結構介導：ATP依賴的核小體重塑復合體，通過水解作用改變核小體構型；組蛋白共價修飾復合體，催化對核心組蛋白N-末端尾部進行共價修飾，改變核小體構

10、型，為其它蛋白提供與DNA作用的結合位點； 動態(tài)的染色質重塑是大多數以DNA為模板的生物學過程的基礎，如基因轉錄、DNA的復制與修復、染色體濃縮與分離、細胞調亡等，因而異常的染色質重塑與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展直接有關 不同的染色質重塑可導致不同的腫瘤，但其與腫瘤發(fā)生與發(fā)展的關系尚有待進一步探索,非編碼RNA調控 非編碼RNA分為長鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA。長鏈非編碼RNA在基因簇甚至整個染色體水平發(fā)揮順式調節(jié)作用；短鏈RNA在基因組水平對基因表達發(fā)揮調控作用。 短鏈RNA能介導mRNA降解、誘導染色質的結構的改變從而決定細胞的分化命運、對外源核酸序列有降解作用以保護本身的基因組，常見的短鏈R

11、NA有小干涉RNA(Short interfering RNA，SiRNA)和微小RNA(MicroRNA, miRNA)。 干擾RNA：與真核生物mRNA編碼區(qū)同源的外源性雙鏈RNA (dsRNA)能特異性地誘導其同源mRNA的降解，導致相應基因的沉默，hx 現象稱為RNA干擾(RNA i)，RNA i依賴于小干擾RNA與靶序列之間嚴格的堿基配對，有很強的特異性； 微小RNA：由核內的Pri-miRNA在Rnase 核酸酶作用下加工成發(fā)夾狀pre-miRNA，轉運到胞質后在雙鏈RNA特異性RNA內切酶(Dicer)作用下被切割成雙鏈miRNA。解鏈成單鏈后進入核糖蛋白復合體，參與對mRNA的

12、切割或翻譯抑制。,RNA干擾分為兩個階段： 酶切啟動階段：外源雙源RNA(dsRNA)通過外源導入、轉基因、或者病毒感染等方式進入細胞后，專一性的雙鏈RNA內切酶識別dsRNA并將其切成大量的碎片(siRNA)，能識別同源的靶mRNA序列，啟動RNA干擾； RISC形成：siRNA與特異性蛋白結合后解鏈，其反義鏈與核酶復合物結合，形成誘導RNA沉默的復合物(RNA induced silencing complex, RISC)。RISC形成后結合到靶mRNA上，在RNA依賴的RNA聚合酶催化下形成dsRNA，后者又會在雙鏈RNA內切酶作用下降解為siRNA。 siRNA天然的作用是封閉轉座子

13、，它們能在染色質水平、轉錄水平、轉錄后水平、基因水平對基因表達進行調控。 實驗室研究表明，部分miRNA與多種腫瘤、癌癥的發(fā)生密切有關。,不同表觀遺傳修飾之間的相互調控： 表觀遺傳修飾能從多個水平上調控基因的表達，而不同水平的調控之間又相互關聯，在真核細胞內形成了一個完整的表觀遺傳調控的網絡。 miRNA的表達受甲基化及其它表觀遺傳機制的調控； siRNA可誘導DNA甲基化,腫瘤細胞表觀遺傳學異常的分子機制,印記丟失： 遺傳印記是指，來自父母雙方的等位基因在通過精子和卵子遺傳給子代時發(fā)生了修飾，使帶有親代印記的等位基因具有不同的表達特征。 正常的基因印記受DNA甲基化和組蛋白甲基化及乙?；恼{

14、控，以保證父系基因的決定地位，即一對等位基因中一個發(fā)生轉錄，另一個被抑制。 腫瘤中一些基因丟失其遺傳印記會導致異常情況發(fā)生，如等位基因的共表達。如： 胚胎細胞只有母系染色體時成為畸胎瘤、只有父系染色體時成為葡萄胎； 結腸癌患者結腸上皮類胰島素生長因子2(IGF2)等位基因共表達，致強效生長刺激，與不斷升高的結腸癌風險有關； 而在Wilms瘤，IGF2基因印記丟失，產生一種異常的未分化細胞，其不斷增生而不受調控及修復基因的影響，最終引發(fā)腎癌；,基因印記丟失的小鼠模型： Holm等通過破壞DNA甲基轉移酶DNMT1，暫時誘導基因組脫甲基化，從而建立基因印記丟失的小鼠模型。 來自該模型的成纖維細胞可

15、在免疫缺陷小鼠體內形成腫瘤，并具有體外永生的特性。 Holm認為，單獨的印記丟失就可使細胞發(fā)生癌性增生。因為細胞降低了永生化的域值，在沒有基因突變的情況下，可遺傳的基因表達模式的變化導致干細胞的異常增生，進而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。,DNA甲基化 腫瘤的表觀遺傳學異常以DNA甲基化的模式改變?yōu)橹?，包括整個基因組的低甲基化和啟動子區(qū)的高甲基化； 目前最受關注的是啟動子區(qū)CpG島的高甲基化導致抑癌基因的轉錄沉默，這很可能是癌性增生的最初表現； Issa等研究證實存在CpG島甲基化表型，即同時存在多個基因具有腫瘤特異性CpG島甲基化。 常見的抑癌基因P16就是因為啟動子區(qū)CpG島高甲基化而沉默的，該基

16、因功能的丟失可延長干細胞的壽命、導致基因組不穩(wěn)定性、早期癌性病變易于發(fā)生。 與腫瘤異常甲基化狀態(tài)相關的酶是DNA甲基轉移酶(DNMTs)，其催化在CpG島胞嘧啶5位上共價連接上甲基基團。,DNMT酶包括DNMT1、DNMT3b和DNMT3a，DNMT1與甲基化維持有關，即在半甲基化DNA中以甲基化單鏈為模板對互補鏈進行甲基化；DNMT3b和DNMT3a介導DNA雙鏈的從頭甲基化。 多種組織來源的腫瘤細胞可DNMT蛋白及活動水平增高，DNMT抑制劑抑制DNMT活性可延緩小鼠肺癌模型中的癌性增生。 實驗研究發(fā)現基因敲除DNMT1后，腫瘤總體甲基化水平僅微弱減少，而敲除DNMT3b可使95%的基因組

17、5-甲基胞嘧啶去甲基化、全部啟動子去甲基化、沉默基因活化表達。說明DNMT1的功能以維持甲基化及基因表達抑制為主，而DNMT3具有從頭甲基化作用。 盡管DNMT1對于未甲基化的物質幾乎無甲基化作用，但其過度表達依然可導致未甲基化的人類CpG島序列從頭甲基化，因此，其在腫瘤細胞很可能具有上述能力。,組蛋白修飾與染色質重塑： 核小體是染色質高級構造的基本結構，組蛋白是核小體的重要組成部分，核小體由147對堿基包裹8個組蛋白構成的核心蛋白構成，147對堿基的位置和組蛋白的修飾對于維持基因的表達模式及染色體結構具有重要作用，以此來調控基因的表觀遺傳。 核小體的各組分處于精細的穩(wěn)定狀態(tài)，任何外界的微小變

18、化可能對細胞表型及轉錄模式產生巨大的影響 對于染色質包裝來說，組蛋白修飾與DNA甲基化之間有密切的聯系，各種選擇型去乙酰化酶、DNMTs復合體、特定甲基化CpG序列結合蛋白家族(MBDs)之間相互聯系。在調控基因轉錄時甲基化和賴氨酸乙酰化之間相互協(xié)作，但甲基化起主導作用；MBDs具有特異性結合基因啟動子的能力，和DNA高甲基化及腫瘤中沉默基因有關,組蛋白乙酞基轉移酶(HATs)和組蛋白去乙酞化酶(HDACs)相互作用調節(jié)組蛋白乙酞化的平衡，同時組蛋白甲基轉移酶(HMTs)和組蛋白去甲基化酶有效的調控著組蛋白甲基化； 組蛋白賴氨酸乙酞化與轉錄激活相關聯，而這些殘基的甲基化則同時與激活以及抑制狀態(tài)

19、有關； 組蛋白乙酞化和甲基化模式通過不同的效應蛋白而體現，含有bromo結構域的蛋白質，可以識別乙酞化的賴氨酸殘基；含chromo結構域，可以結合到甲基化的賴氨酸殘基上，作用于組蛋白并引起基因轉錄。 賴氨酸甲基化有單甲基化，雙甲基化以及三甲基化3種不同的形式，他們顯著擴大了組蛋白復合體的密碼信息。比如，H3K9乙?；虷3K4 甲基化是表達的活躍標志; 而H3K9和H3K27的單、雙和三甲基化的大量出現則是轉錄抑制相關的組蛋白甲基化的標志。,早期腫瘤表觀遺傳學改變調控的潛在網絡 表觀遺傳學改變在干細胞的異常克隆性增殖及腫瘤的易感性方面發(fā)揮關鍵作用 對慢性炎癥導致腫瘤的研究發(fā)現，正常細胞對細胞應

20、激和損傷的應答是暫時的，抑制細胞的存活，而慢性暴露于應激狀態(tài)下則引起上述應答反應異常延長從而可能導致異常的克隆增生。 上述異常應答反應涉及SIRT1的異常增加、抑癌基因p53的轉錄抑制、HIC1的沉默： SIRT1是一種多功能應激蛋白，組蛋白去乙酰化酶的一種，參與p53基因的翻譯后修飾、從而下調p53轉錄活性； HIC1基因是鋅指結構域成員，既是p53的激活目標，又與SIRT1組成復合體并向SIRT1啟動子聚集、抑制其轉錄；,SIRT1的去乙?；饔眠€可導致并維持配對基因的轉錄沉默，誘導降低SIRT1的活性可以使這些沉默基因重新表達，這一過程涉及到Wnt發(fā)育信號通路； Wnt發(fā)育信號通路對成人

21、細胞更新時干細胞的擴增及維持有重要作用； 在結腸癌時，由于對抗Wnt信號途徑的SFRPs基因家族首先發(fā)生了沉默，隨后當下游通路基因突變時，由于拮抗因素，使Wnt通路過度激活，從而促進腫瘤的發(fā)展；而腫瘤細胞實驗時，敲除SIRT1基因可以使已經沉默的SFRPs基因重新激活，從而逆轉結腸癌及乳腺癌中Wnt途徑的過度激活； SIRT1和PcG復合物在腫瘤中異常的基因沉默維持過程中可能共同發(fā)揮重要作用。,HIC1基因的純合性缺失或表觀遺傳丟失均可導致SIR1基因表達增加，從而降低p53對正常細胞的作用； HIC1基因的表觀遺傳沉默也涉及其他路徑，HIC1基因沉默后可導致Wnt 通路的過度激活。HIC1結

22、合TCF-4后可以募集p-catenin到緊湊的核結構上，構成HlC1體，就會妨礙驅動正常的Wnt通路的正常核p-catenin-TCF復合體的形成。,腫瘤表觀遺傳學在干細胞及酵母中的研究,過去的觀點認為，成熟的干細胞發(fā)生異常的克隆性增生，導致細胞的異質性的不斷增強，因此很多腫瘤呈現出一系列的演進過程； 新的觀點強調腫瘤增生是由腫瘤干細胞引起的，腫瘤干細胞內的一些分子可以促進腫瘤的發(fā)展，如特定干細胞的Oct4的過表達可促進腸及其他器官的上皮細胞的腫瘤迅速發(fā)生。 胚胎干細胞中，細胞干細胞化的轉錄因子包括：OCT4、NANOG、SOX2，都定位于一個限制性的啟動子區(qū)域，這些轉錄因子、細胞增殖調控基

23、因、組織分化調控基因都普遍與干細胞的多潛能性相關，大多保持低甲基化狀態(tài)。,細胞干細胞化相關轉錄基因近側的啟動子區(qū)包含PcG蛋白及三甲基化H3K23，在胚胎發(fā)育中，當基因需要表達時，PcG的影響可被逆轉或消失，到后續(xù)的細胞成熟或分化階段，PcG復合物的作用可重新發(fā)揮，保持長時間的基因沉默。 PcG蛋白保持一個精確協(xié)調的、可塑的基因表達模式，其誘導的染色體標記在胚胎發(fā)育過程中能夠保持干細胞和分化發(fā)育細胞表型之間的平衡,表觀遺傳修飾與腫瘤治療,與基因突變、基因缺失不同，表觀遺傳修飾具有可逆性，因此可在腫瘤或癌前病變中，通過去甲基化或乙?；拇胧謴湍承╆P鍵基因的表達，達到防治腫瘤的目的。 DNA甲基轉移酶(DN