1、,2,第三章 植物抗旱生理,水資源短缺、干旱是一個(gè)長(zhǎng)期存在的世界性難題，全球干旱、半干旱地區(qū)占陸地面積的35，遍及世界60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。作為世界三大糧食產(chǎn)出國(guó)的中國(guó)、印度和美國(guó)，糧食產(chǎn)量占世界的50左右，近幾年來(lái)出現(xiàn)了嚴(yán)重的水資源危機(jī)，從而導(dǎo)致糧食嚴(yán)重減產(chǎn)。 干旱是我國(guó)糧食生產(chǎn)的首要災(zāi)害，在水資源危機(jī)日益嚴(yán)重的今天和未來(lái)，開(kāi)展作物抗旱節(jié)水理論與技術(shù)研究，具有重大的現(xiàn)實(shí)和戰(zhàn)略意義。 正如“綠色革命”的功臣、諾貝爾和平獎(jiǎng)獲得者Borlaug(2000)所說(shuō)：“我們?nèi)绾卧谟邢薜乃Y源下，生產(chǎn)更多的食物來(lái)滿足日益快速增長(zhǎng)的人口需要，不可置疑的結(jié)論是：人類(lèi)在21世紀(jì)要開(kāi)展藍(lán)色革命讓每一滴水生產(chǎn)出更多的

2、糧食?！?第一節(jié) 干旱脅迫下植物的生理變化及適應(yīng)途徑,一、干旱脅迫下植物的生理變化,1、光合作用速率下降,氣孔限制 非氣孔限制 PSII光化學(xué)活性降低 電子傳遞受阻 Rubisco活性下降 RuBP再生抑制 同化物運(yùn)輸受阻,2、呼吸速率變化：先升后降,原因：氧化磷酸化解偶聯(lián) 結(jié)果：能量供應(yīng)減少,3、碳水化合物代謝與運(yùn)輸變化,代謝： 淀粉等大分子物質(zhì)減少，可溶性糖增多 葉中糖增加，莖中糖減少 運(yùn)輸 受抑 加速向繁殖器官運(yùn)輸,4、蛋白質(zhì)代謝變化,總體變化： 分解合成 證據(jù) 同位素標(biāo)記證明，氨基酸摻入蛋白質(zhì)減少 多聚核糖體減少 游離氨基酸積累 調(diào)節(jié)部位 環(huán)己亞胺（肽鏈延長(zhǎng)抑制劑）實(shí)驗(yàn)證明， 翻譯水平

3、調(diào)節(jié),5、核酸代謝變化,DNA含量較穩(wěn)定 RNA含量明顯減少,6、激素變化,IAA 干旱促進(jìn)IAAO活力，降低IAA水平 IAA極性運(yùn)輸受阻 CTK 根尖向地上部運(yùn)輸減少 活性下降 GA 含量減少 ABA含量激增 ETH合成增加（ACC合成酶活性提高）,7、膜脂過(guò)氧化加劇,防御酶活性降低 體內(nèi)抗氧化劑減少 活性氧過(guò)量積累,二、植物對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)途徑,形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 滲透調(diào)節(jié) 細(xì)胞壁彈性調(diào)節(jié) 氣孔調(diào)節(jié) 活性氧代謝調(diào)節(jié) 激素調(diào)節(jié),1、葉片大小與厚度 2、比葉重 3、氣孔 4、角質(zhì)層與機(jī)械組織 5、超微結(jié)構(gòu),第二節(jié) 植物形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗旱性,一、葉片,1、根系生長(zhǎng)、分布與抗旱性 2、根系形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗旱性

4、 3、根系傷流與抗旱性,二、根系,第三節(jié) 植物在水分脅迫下的滲透調(diào)節(jié),水分脅迫：由于干旱缺水對(duì)植物正常生理功能 的干擾。 滲透脅迫：環(huán)境與生物之間由于滲透勢(shì)的不平 衡而對(duì)植物造成的脅迫。 滲透調(diào)節(jié)（osmoregulation or osmotic adjustment) 植物在干旱、鹽漬等逆境條件下，通過(guò)代謝活動(dòng)增加細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)濃度，降低其滲透勢(shì)，從而降低水勢(shì)，從外界低水勢(shì)介質(zhì)中繼續(xù)吸水，保持一定膨壓，維持正常生理活動(dòng)。,一、滲透調(diào)節(jié)的方式和原初機(jī)理,1、調(diào)節(jié)方式 wsp 植物降低s的途徑 細(xì)胞內(nèi)水分減少，溶質(zhì)濃縮 細(xì)胞體積變小 通過(guò)代謝活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)主動(dòng)增加,2、原初機(jī)理（Zimmerm

5、ann 機(jī)電模型）,水分脅迫 膨壓變化 膜收縮或伸展 膜電位變化 機(jī)械力轉(zhuǎn)化為電信號(hào) 誘導(dǎo)生化反應(yīng) 增加溶質(zhì) 滲透調(diào)節(jié),二、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)和作用,按來(lái)源： 外界進(jìn)入細(xì)胞 細(xì)胞內(nèi)合成 按性質(zhì)： 有機(jī)物 無(wú)機(jī)離子 按積累部位： 液泡型 胞質(zhì)型,1、無(wú)機(jī)離子,逆境脅迫下植物積累無(wú)機(jī)離子的種類(lèi)和數(shù)量因植物的種、品種、器官不同而有差異。 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42-、NO3-等對(duì)滲透調(diào)節(jié)均有貢獻(xiàn)。 中度水分脅迫下，高梁葉片主要積累K+、 Mg2+；向日葵主要積累K+、Ca2+、Mg2+、NO3- 無(wú)機(jī)離子積累為主動(dòng)吸收過(guò)程 無(wú)機(jī)離子積累部位：液泡,2、脯氨酸 proline,

6、50年代中期，Kemble等發(fā)現(xiàn)，在受旱的黑麥草葉子中，有pro積累，后來(lái)發(fā)現(xiàn)許多植物都有這種現(xiàn)象：如：barley, wheat, sorghum, soybean, cotton, tobacco, sunflower, cucumber, etc, Stemard后來(lái)做了一系列試驗(yàn)，提出了pro作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的觀點(diǎn)，現(xiàn)已被普遍接受。,(1) pro合成的途徑,Glu Glu激酶 谷氨酰磷酸 谷氨酰磷酸還原酶 鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶 鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶 谷氨酰半縮醛 鳥(niǎo)氨酸 -酮-氨基戊酸 同步環(huán)化 環(huán)化 吡咯啉5羧酸（P5C） 吡咯啉羧酸 （PC） pro氧化酶 P5C還原酶 PC還原酶 Pro脫氫酶

7、 Proline,(2)Pro積累原因,Pro合成增加： 標(biāo)記glu在植物失水后迅速轉(zhuǎn)化為pro。 protein合成受阻： 減少pro向蛋白質(zhì)摻入。 pro氧化受抑： 干旱時(shí)，不僅pro氧化受抑，而且氧化的中間產(chǎn)物發(fā)生逆轉(zhuǎn)，再生成pro。這與線粒體膜透性變化有關(guān)，其機(jī)理是： Pro合成酶位于細(xì)胞質(zhì)，分解酶位于線粒體。在滲透脅迫下，線粒體膜透性發(fā)生變化，pro進(jìn)入線粒體受阻，吡咯啉5羧酸(pro前體)可以從線粒體出來(lái)，用于pro合成。,現(xiàn)在已知，在低溫、干旱、高溫、鹽漬、營(yíng)養(yǎng)不良、微生物感染、大氣污染等逆境下，均可引起pro積累，尤其以干旱脅迫下pro積累最為明顯，從0.20.7mg/gDW上

8、升到4050mg/gDW,增加了70200倍。 此外，K、ABA可使干旱誘導(dǎo)的pro增加更多更快。,特點(diǎn)： 分子量?。?15 溶解度高：162.3g/100gH2O 是一種偶極含氮化合物，生理pH下不帶靜電荷 對(duì)植物無(wú)害，600mol.L-1對(duì)酶無(wú)抑制作用 主要在細(xì)胞質(zhì)中積累（胞質(zhì)型滲調(diào)物質(zhì)） 作用 保持細(xì)胞與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失 穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（對(duì)蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)的作用） 與細(xì)胞內(nèi)的一些化合物形成聚合物，類(lèi)似親水膠體，具有保水作用 作為無(wú)毒氮源,（3）pro的特點(diǎn)和作用,3、甜菜堿(betaine),甜菜堿最早是在旱生植物枸杞（Lycium brabraum）中發(fā)現(xiàn)的。現(xiàn)在已知有

9、12種，其中最簡(jiǎn)單、研究最多的是甘氨酸甜菜堿(glycinebetaine)，已在28科、78種植物中檢測(cè)到，根、莖、葉、花均有分布。如，上世紀(jì)70年代中期，Storey等發(fā)現(xiàn)，在鹽分和水分脅迫下，大麥積累甜菜堿的水平與耐旱性呈正比。,（1）積累特點(diǎn),Pro:水分脅迫10min即可見(jiàn)積累，復(fù)水后很快消失； Betaine:水分脅迫24h才見(jiàn)積累，復(fù)水后降解也較緩慢。因其穩(wěn)定，被認(rèn)為是持久性的滲調(diào)物質(zhì)。由于穩(wěn)定，很適合于作為抗旱性選擇指標(biāo)。,（2）生物合成,Ser CDP甘油二酯 CO2 PS 乙醇胺 P-乙醇胺 CDP-乙醇胺 PE CH3 一甲基乙醇胺 P-甲基乙醇胺 CDP-MME P-M

10、ME CH3 二甲基乙醇胺 P-DME CDP-DME PDME CH3 膽堿 P-PC CDP-PC PC 膽堿單加氧酶 甜菜醛 甜菜醛脫氫酶 甜菜堿,(3)特點(diǎn)與作用,特點(diǎn)： 分子量小：117 溶解度高：157g/100gH2O 生理pH下不帶靜電荷 對(duì)細(xì)胞無(wú)害。0.51mol.L-1高濃度對(duì)蘋(píng)果酸脫氫酶無(wú)抑制作用 分布：以細(xì)胞質(zhì)為主（屬于胞質(zhì)型滲調(diào)物質(zhì)） 作用： 維持細(xì)胞與環(huán)境的滲透平衡，參與滲透調(diào)節(jié) 參與穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)與功能 調(diào)節(jié)離子在細(xì)胞中的分布,3、可溶性糖和多元醇,WSC：Sucrose; glucose; fructose; galactose; 游離AA：Asn; Glu

11、; (Pro) 糖醇：甘露醇、松醇、山梨醇 積累原因： 大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)分解加強(qiáng) 光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化方向改變，轉(zhuǎn)向產(chǎn)生蔗糖為主,三、滲透調(diào)節(jié)的生理功能,1、維持細(xì)胞膨壓,OA的主要作用，就是全部或部分維持膨壓，從而有利于其各種生化反應(yīng)的進(jìn)行。 Rice: 在慢速干旱條件下，盡管組織水勢(shì)下降，但是由于滲調(diào)作用，葉片膨壓并沒(méi)變化。,2、保持細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng),膨壓對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有關(guān)鍵作用，由于水分脅迫下，通過(guò)滲透調(diào)節(jié)可以維持細(xì)胞膨壓，因而可以保持細(xì)胞在水分脅迫下繼續(xù)生長(zhǎng)。,3、維持氣孔開(kāi)度和光合作用,氣孔調(diào)節(jié)：維持氣孔開(kāi)放，CO2進(jìn)入細(xì)胞 非氣孔調(diào)節(jié)：Rubisco活性 RuBP再生能力 電子傳遞速率

12、PSII活性 類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)完整性,4、延遲卷葉 5、增加干物質(zhì)積累,四、滲透調(diào)節(jié)與抗旱育種,1、OA與作物抗旱性呈顯著正相關(guān)： 通過(guò)corn, sunflower, wheat, barley等為材料研究證明。 2、OA是可遺傳性狀，由單基因控制 無(wú)論是在輕度或嚴(yán)重水分脅迫下，滲調(diào)能力強(qiáng)的品種，其產(chǎn)量、收獲指數(shù)、水分利用效率均高于OA弱的基因型。 3、利用雜交方法，可以產(chǎn)生OA強(qiáng)的品系，表明 OA作為選擇指標(biāo)是可行的。,五、滲透調(diào)節(jié)基因工程和滲調(diào)蛋白研究,1、Genetic engineering of osmotic adjustment,尋找目標(biāo)基因 首先研究確定參與滲調(diào)的關(guān)鍵物質(zhì)，分析控制

13、這些物質(zhì)變化的基因。 基因的分離、導(dǎo)入、整合、表達(dá)、遺傳 滲調(diào)基因的應(yīng)用進(jìn)展 微生物方面工作較多，也較成功。 高等植物：Kuch等利用羥脯氨酸與脯氨酸的拮抗作用原理，在大麥中獲得了高產(chǎn)pro的突變體，突變體葉片中pro含量高于親本，抗旱性也明顯增強(qiáng)。,現(xiàn)已搞清的身?xiàng)l基因有： kdp：在滲透脅迫下，誘導(dǎo)K+吸收和運(yùn)輸，促使K+在細(xì)胞內(nèi)積累?；虮磉_(dá)受滲透勢(shì)控制。 proU：促進(jìn)甜菜堿和脯氨酸在細(xì)胞內(nèi)積累，基因表達(dá)受滲透勢(shì)控制。 控制pro合成酶系統(tǒng)的基因： proB: Glu激酶 proA：谷氨酰磷酸還原酶 proC：吡咯啉5羧酸還原酶 bet: 編碼betaine合成酶系。,2、滲調(diào)蛋白（Os

14、motin）,Osmotin: 在滲透脅迫下產(chǎn)生的、具有增強(qiáng)細(xì)胞抗?jié)B透脅迫能力的蛋白質(zhì)，也叫滲調(diào)素。 Osmotin是一種逆境誘導(dǎo)蛋白，早在1962年，人們從果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白，以后在動(dòng)物、植物、微生物均發(fā)現(xiàn)在逆境下，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，叫做逆境脅迫蛋白。 用NaCl適應(yīng)的煙草培養(yǎng)細(xì)胞系，或受到水分脅迫的番茄培養(yǎng)細(xì)胞系，可以新合成一些分子量不同的蛋白質(zhì)，研究最多的是26kd蛋白。 Singh 脅變b為材料的斷裂脅變。 對(duì)于不同材料，在彈性脅變區(qū)內(nèi)的彈性性質(zhì)可能有以下三方面的差別： 產(chǎn)生彈性脅變所要求的最低脅強(qiáng)(f)不同； 彈性模量不同； 能產(chǎn)生彈性脅變的范圍或在彈性限度內(nèi)所能產(chǎn)生的形變

15、的大小(即a值的大小)不同。 對(duì)于植物細(xì)胞,以上三 方面的性質(zhì)均與細(xì)胞的緊張度的維持有關(guān)。,2、細(xì)胞的容積彈性模量,楊氏模量?jī)H適用于材料的線性形變，對(duì)于植物細(xì)胞，在膨壓作用下所產(chǎn)生的形變?yōu)轶w積變化，不能簡(jiǎn)單地套用上式加以處理，于是提出了容積彈性模量(Bulk modulus of elasticity)的概念。并將其定義為: dp dp V V dV/V dv 式中V為容積彈性模量，p為膨壓，V為細(xì)胞體積，由式中可知，細(xì)胞的容積彈性模量就是在膨壓作用下細(xì)胞每產(chǎn)生單位體積變化所需要的膨壓變化。,3、植物組織或器官的容積彈性模量,測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的膨壓體積關(guān)系并由此計(jì)算出細(xì)胞的V值難度較大。早期工作通

16、過(guò)測(cè)量在不同濃度溶液中細(xì)胞體積的變化間接求得，但很不準(zhǔn)確。Green等首次利用壓力探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)了大型藻類(lèi)細(xì)胞的膨壓測(cè)量，但對(duì)一般小型細(xì)胞則難以實(shí)現(xiàn)。 Tyree曾對(duì)兩者關(guān)系進(jìn)行過(guò)理論推導(dǎo)，認(rèn)為植物器官的容積彈性模量近似地等于各個(gè)細(xì)胞容積彈性模量的平均值。從植物水分關(guān)系與抗旱性的實(shí)際應(yīng)用角度考慮，測(cè)量整個(gè)葉片的容積彈性模量(v)意義較大，可利用壓力室技術(shù)進(jìn)行測(cè)量（P-V曲線測(cè)定，略）。,三、容積彈性模量的生理意義,v大小可以： 表示植物材料彈性的好壞 反映細(xì)胞壁在膨壓作用下可進(jìn)行伸縮范圍的大小 不同的植物品種，其細(xì)胞壁彈性存在差異。v較小的材料，其彈性較好，在干旱脅迫下相對(duì)含水量降低時(shí)，膨壓下降

17、較慢，可在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持膨壓，從而維持其正常生理功能和生長(zhǎng)速率。v大的材料則相反。 下圖是兩個(gè)抗旱性不同的大豆品種葉片pRWC關(guān)系曲線：,通過(guò)比較可見(jiàn)，雖然吸水飽和時(shí)小粒豆1號(hào)的最大p低于魯豆4號(hào)，但隨著RWC下降，小粒豆1號(hào)的p下降緩慢，直到RWC降至接近60時(shí)膨壓才消失；而魯豆4號(hào)的p則隨著RWC下降而急劇下降，RWC降至87作用時(shí)p即消失。如果將膨壓消失點(diǎn)作為萎蔫點(diǎn)，顯然，小粒豆1號(hào)能在更低的RWC下維持膨壓而不至于萎蔫。 從pRWC曲線與橫軸的交叉點(diǎn)來(lái)看，小粒豆1號(hào)的細(xì)胞壁的彈性伸縮范圍明顯大于魯豆4號(hào)。 大豆葉片的不但因品種而異，也因大豆植株所經(jīng)受的水分脅迫程度而改變。下表為不同水

18、分脅迫條件下兩個(gè)大豆品種的v(max)。可以看出：分枝期輕度水分脅迫，均能在一定程度上改善葉片的彈性(v降低)，這可能是細(xì)胞壁上的生化過(guò)程在輕度水分脅迫下進(jìn)行的主動(dòng)適應(yīng)。但嚴(yán)重水分脅迫則使v(max)加大，這有可能是細(xì)胞壁在嚴(yán)重干旱條件下硬化所致。在鼓粒期，兩品種均失去了降低v的能力。,表1 水分脅迫對(duì)兩個(gè)大豆品種v(max) 的影響 品 種 魯豆4號(hào) 小粒豆1號(hào) 水分處理 分枝期 結(jié)莢期 分枝期 結(jié)莢期 CK 31.4 11.5 13.4 15.3 輕度干旱 17.1 18.7 8.8 18.0 中度干旱 20.1 19.7 9.3 17.3 嚴(yán)重干旱 28.9 24.9 20.2 19.5

19、,由此可見(jiàn)，研究作物葉片的彈性特征對(duì)于闡明其抗旱機(jī)理具有重要的作用。作物葉片在干旱條件下的彈性調(diào)節(jié)很可能是除下滲透調(diào)節(jié)之外又一種重要的干旱話應(yīng)方式，這種方式在禾本科作物上是否存在尚待研究，但對(duì)大豆而言，則彈性調(diào)節(jié)至少能發(fā)揮一定作用。,早期的觀點(diǎn)認(rèn)為，干旱對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育得影響，只是水分虧缺對(duì)植物得直接損傷效應(yīng)，而且正是這種損傷效應(yīng)抑制了細(xì)胞得伸長(zhǎng)，氣孔開(kāi)度、光合作用等生理過(guò)程，從而導(dǎo)致了產(chǎn)量的下降。 但是，近年來(lái)越來(lái)越多得實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在水分虧缺造成各種損傷現(xiàn)象之前，植物就對(duì)干旱做出了適應(yīng)性的調(diào)節(jié)反應(yīng)，以便使植物做出最優(yōu)化選擇(optimization)。因此，植物一定具有感知、傳遞土壤干旱脅迫信號(hào)

20、、使之做出快速反應(yīng)的能力。 目前，國(guó)際上對(duì)植物逆境信號(hào)傳遞的研究引起了普遍關(guān)注。本屆簡(jiǎn)單介紹干旱脅迫下植物如何感知和傳遞脅迫信號(hào)、以及信號(hào)的種類(lèi)、性質(zhì)和作用機(jī)理。,第四節(jié) 干旱脅迫下植物根與地上部的信號(hào)傳遞,一、植物根冠通訊信號(hào),（一）信號(hào)種類(lèi),1、水力信號(hào)（hydraulic signals）,hydraulic signal: 由于土壤水分含量的下降引起葉片水分狀況（w, s,p, RWC等）變化，進(jìn)而影響植物的生理功能。 葉片水勢(shì)是最常用的植物水分狀況指標(biāo)，人們常把w與脅迫程度相聯(lián)系。Kramer等把土壤干旱對(duì)植物的影響解釋為： 土壤干旱，水分減少根系吸水減少蒸騰作用存在葉片w下降膨壓下

21、降激素合成與運(yùn)輸變化生理功能變化。 可見(jiàn)，這種類(lèi)型的根冠通訊是靠水的傳遞來(lái)實(shí)現(xiàn)的，即水信號(hào)傳遞。 然而，目前又有許多實(shí)驗(yàn)證明，在葉片水分狀況還沒(méi)有表現(xiàn)出可檢測(cè)的變化之前，地上部對(duì)土壤干旱的反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生了，從而避免了或推遲了葉片和枝條脫水，以維持正常生長(zhǎng)發(fā)育。這說(shuō)明植物根系和地上部之間出了水信號(hào)以外，還有其他信號(hào)存在。,2、化學(xué)信號(hào)(chemical signals),chemical signal: 指能夠感知和傳遞土壤干旱信息到地上部反應(yīng)部位，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的激素或除水以外的其他化學(xué)物質(zhì)。 Bates ,功能蛋白 ： 它們?cè)谥参锟鼓鏅C(jī)制中發(fā)揮重要作用 。,這些水分脅迫誘導(dǎo)基因產(chǎn)物不僅通

22、過(guò)重要代謝保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu),而且起調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)作用： 通過(guò)水分通道蛋白、ATP酶、跨膜受體蛋白、離子通道、有機(jī)小分子運(yùn)載體等膜蛋白加強(qiáng)了細(xì)胞與環(huán)境的信息交流和物質(zhì)交換; 通過(guò)酶蛋白的作用合成各種滲透保護(hù)劑，提高細(xì)胞滲透吸水能力; 通過(guò)LEA蛋白、滲調(diào)蛋白、抗冰凍蛋白、分子伴侶、蛋白酶、熱激蛋白等逆境誘導(dǎo)蛋白提高細(xì)胞抗脫水能力; 通過(guò)SOD. CAT, APX、POD等提高細(xì)胞排毒、抗氧化防御能力; 通過(guò)蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、磷脂酶C等調(diào)控蛋白提高細(xì)胞內(nèi)信息傳遞和基因表達(dá)能力。,一、水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的種類(lèi)和誘導(dǎo)機(jī)制,（一）水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的種類(lèi)和特性,由于分類(lèi)依據(jù)的不同,水分脅迫誘導(dǎo)蛋白被分

23、成不同的類(lèi)別。 根據(jù)對(duì)ABA的依賴性,可以將其分為ABA依賴蛋白(RAB)和非ABA依賴蛋白。 根據(jù)水分脅迫誘導(dǎo)蛋白在誘導(dǎo)時(shí)間上的差別將擬南芥中的水分脅迫誘導(dǎo)蛋白分成兩大類(lèi):ERD(脫水反應(yīng)早期蛋白)和RD(脫水反應(yīng)蛋白)。這是由于擬南芥在遭受干旱脅迫大約2小時(shí)后ABA開(kāi)始大量合成,10小時(shí)后達(dá)到最高水平,所以將遭受干旱脅迫1小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)稱為ERD, 10小時(shí)后檢測(cè)出的誘導(dǎo)蛋白稱為RD。一般來(lái)說(shuō),RD多為RAB蛋白,ERD多為非RAB蛋白。,按其功能不同,又可將水分脅迫誘導(dǎo)蛋白分成兩大類(lèi): 第一類(lèi)：在細(xì)胞內(nèi)直接發(fā)揮保護(hù)作用的功能蛋白。 第二類(lèi)：參與水分脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或基因的表達(dá)調(diào)控,間接

24、對(duì)植物起保護(hù)作用的調(diào)節(jié)蛋白。,第一類(lèi)水分脅迫誘導(dǎo)蛋白主要包括: (功能蛋白）,1、滲調(diào)素,這是最早發(fā)現(xiàn)的一種水分脅迫誘導(dǎo)蛋白,它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞的滲透勢(shì)。其中多數(shù)與LEA蛋白,尤其是脫水素(dehydrin)有很大的同源性，一般作為脫水保護(hù)劑,幫助細(xì)胞保持最小水勢(shì)并穩(wěn)定胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。 另外Velaseo(1994)等還從更蘇植物中鑒定出了一組特性類(lèi)似干LEA蛋白、對(duì)脫水敏感的基因家族CdeTll24。,2、膜蛋白,在非生物脅迫下首先引起膜透性的改變、膜結(jié)構(gòu)的變化以及發(fā)生膜脂的過(guò)氧化作用,因此逆境條件下植物誘導(dǎo)合成了許多膜蛋白,以維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性。,3、代謝酶類(lèi),在水分脅迫條件

25、下,活性氧大量產(chǎn)生并發(fā)生異常積累,相應(yīng)的活性氧清除系統(tǒng),如超氧化物歧化酶,過(guò)氧化物酶等酶系統(tǒng)或維生素E、維生素C、谷胱甘肽、半胱氨酸、類(lèi)胡蘿卜素等非酶系統(tǒng)的活性就會(huì)提高,并與自由基反應(yīng),清除過(guò)量的活性氧,可使機(jī)體受到保護(hù)以維護(hù)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和代謝。 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶,這些酶的誘導(dǎo)使得滲調(diào)物質(zhì)的合成大大增加。例如脯氨酸合成中的關(guān)鍵酶P5C合成酶(P5CS)以及與ABA合成有關(guān)的酶。其次就是一些去氧化酶類(lèi)如SOD、POD、GST及二氫葉酸還原酶(DFR)等。 與細(xì)胞基礎(chǔ)代謝途徑如糖酵解和卡爾文循環(huán)有關(guān)的酶如烯醇化酶和磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)、NADP(H)氧化酶以及一個(gè)和木質(zhì)化

26、作用有關(guān)的酶也被干旱脅迫所誘導(dǎo)。另外還發(fā)現(xiàn)干旱脅迫誘導(dǎo)各種形式的半胱氨酸蛋白酶,以降解干旱脅迫下失活蛋白質(zhì)。,4、通道蛋白,其中水孔蛋白可以促進(jìn)水分的長(zhǎng)距離運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)外的跨膜水運(yùn)輸,還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞脹縮等功能。 植物水孔蛋白根據(jù)序列同源性可以分為三類(lèi): 質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIP) 液泡膜內(nèi)在蛋白(TIP) NLM蛋白(nodulin 26 like MIPs, NLM),主要分布于兩個(gè)地方:原生質(zhì)膜和液泡形成體(tonoplast,即液泡膜)。,5、分子伴侶,在脅迫條件下會(huì)導(dǎo)致一些蛋白質(zhì)變性,而分子伴侶(chaperone)的誘導(dǎo)可以防止蛋白質(zhì)及膜的進(jìn)一步變性。,6、運(yùn)輸?shù)鞍?如糖運(yùn)輸?shù)鞍?不僅

27、介導(dǎo)了蔗糖從葉肉細(xì)胞外流、韌皮部裝載、韌皮部卸出和進(jìn)入庫(kù)細(xì)胞儲(chǔ)藏和利用,據(jù)目前的研究結(jié)果來(lái)看它可能在糖運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中還發(fā)揮重要的作用。,第二類(lèi)水分脅迫誘導(dǎo)蛋白主要包括：（調(diào)節(jié)蛋白),磷脂酶C、磷脂酶D、各種蛋白激酶、G蛋白、鈣調(diào)素以及轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等。 在環(huán)境脅迫刺激下,體內(nèi)這些蛋白質(zhì)合成增加,通過(guò)它們將信號(hào)不斷傳遞并放大。,（二）水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的誘導(dǎo)機(jī)制,水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的誘導(dǎo)機(jī)制包括三個(gè)過(guò)程,即水分脅迫信號(hào)的感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)及最終的基因誘導(dǎo)表達(dá)。 在這個(gè)過(guò)程中,ABA合成增加是對(duì)水分脅迫的關(guān)鍵反應(yīng),從9順式新黃質(zhì)(9cisneoxanthin)或9順式紫黃質(zhì)(9cisviolax

28、anthin)到黃質(zhì)醛(xanthoxin)的氧化裂解是ABA合成的關(guān)鍵步驟,催化該反應(yīng)的酶是9順式環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素二加氧酶(9cis-epoxycarotenoid, NCED)。 脅迫期間植物體內(nèi)ABA的濃度以及從根部運(yùn)輸?shù)降厣喜康腁BA大大增多,對(duì)水分脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及干旱水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)都起到了很大的作用,大多數(shù)的水分脅迫誘導(dǎo)蛋白都可以由外源ABA所誘導(dǎo)。,二、LEA蛋白與植物抗旱性,胚胎發(fā)育晚期豐富(late embryogenesis abundant, LEA)蛋白是一種子發(fā)育后期產(chǎn)生的一類(lèi)小分子特異多肽,它是伴隨著種子成熟過(guò)程而產(chǎn)生的。后來(lái)研究認(rèn)為這類(lèi)蛋白與植物耐脫水性密切

29、相關(guān),受植物的發(fā)育階段、ABA和脫水信號(hào)等調(diào)節(jié),在植物的許多組織器官中都有表達(dá)。因此LEA蛋白產(chǎn)生機(jī)制以及與抗旱性的關(guān)系是目前植物抗性生理研究的熱點(diǎn)之一。,（一）LEA蛋白的種類(lèi)、特性與存在部位,根據(jù)它們氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列, LEA蛋白可分為6族: D19 LEA(第1族)、 D11LEA(第2族,又稱脫水素)、 D7LEA(第3族)、 D113LEA(第4族)、 D29LEA(第5族)和 D95LEA(第6族)。 后2族為附加族。,（1）第1族LEA蛋白,這族LEA蛋白具有多拷貝串聯(lián)的20個(gè)氨基酸殘基組成的保守序列,該序列富含高比例的帶電荷氨基酸和甘氨酸,這些氨基酸可占全

30、序列的20%30%。在生理?xiàng)l件下, 70%的多肽可形成隨機(jī)螺旋、比大多數(shù)球蛋白親水性更強(qiáng)。 棉花Dl9、小麥Em、水蘿卜P8B6,胡蘿卜EMBl、玉米E564、大麥Bl9,擬南芥LEA等均屬第1族LEA蛋白。 在許多植物的基因組中高度保守的第1族LEA基因常以一個(gè)基因家族存在, 該家族成員在整個(gè)編碼區(qū),幾乎在20個(gè)氨基酸殘基組成的基元序列區(qū)是高度保守的。但是,不同成員所含基元序列的數(shù)目不同。 許多植物都含第1族LEA基因,它與酵母中的這類(lèi)基因有一定差別。第1族LEA蛋白對(duì)胚乳發(fā)育和植物生長(zhǎng)器官的滲透脅迫有保護(hù)的作用。,（2）第2族LEA蛋白,這族LEA蛋白也稱脫水素(dehydrin),也是一

31、類(lèi)親水性蛋白質(zhì),其一級(jí)結(jié)構(gòu)特征: 在C端或附近具有富含賴氨酸的基元序列,也稱K-片段,K-片段在高等和低等植物中是高度保守的。大約由l5個(gè)氨基酸殘基(EKKGIMDKIKEKIJPG)組成。K-片段、可磷酸化的絲氨酸殘基片段(S-片段)、N端的一些保守序列(Y-片段),以及其他小而保守的重復(fù)區(qū)域(-片段),拼接形成脫水素,多肽的長(zhǎng)度一般為82575個(gè)氨基酸殘基。脫水素的識(shí)別可利用共有Y-片段、S-片段、K-片段,通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行。簡(jiǎn)稱為“YSK速記”。在單個(gè)多肽內(nèi),K-片段的數(shù)量在111個(gè)拷貝之間變化。 根據(jù)脫水素的結(jié)構(gòu)、第2族LEA蛋白的作用可能有兩點(diǎn): 在植物受到干旱失水時(shí),能夠部分替代

32、水分子,保持細(xì)胞液處于溶解狀態(tài)、從而避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)的塌陷,穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、尤其是膜結(jié)構(gòu); 起分子伴侶和親水性溶質(zhì)的作用,在水分脅迫時(shí)穩(wěn)定和保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能。,（3） 第3族LEA蛋白,這族LEA蛋白(D7LEA蛋白)通常含有多拷貝的11個(gè)氨基酸組成的基元序列(TAQAAKEKAGE)。該組LEA蛋白大小差異很大,所含基元序列的拷貝數(shù)少的只有5個(gè)(如棉花LEA D7蛋白), 多的則有幾十個(gè)(油菜LEA 76蛋白有13個(gè)重復(fù)基元數(shù)),大豆cDNA pGmPM8和pGmPM10編碼蛋白含有超過(guò)30個(gè)相連的基元序列。 該組蛋白可依其基元序列的羧基端有無(wú)特定的氨基酸延伸區(qū)段分為兩種類(lèi)型： 一類(lèi)是11個(gè)

33、氨基酸組成的重復(fù)基元序列被與之相似的序列所分離,稱第3族LEA蛋白(); 另一類(lèi)是在羧基末端被特定氨基酸延伸區(qū)段的出現(xiàn)而分隔,稱第3族LEA蛋白()。 大麥的HVA1與小麥的PMA2005在核苷酸水平和氨基酸水平上均有很高的同源性,分別達(dá)91%和95%。這兩個(gè)單子葉植物的基因與胡蘿卜的DC3和棉花的D7關(guān)系很密切,均屬于第3族LEA蛋白(); 小麥的PMAl949,胡蘿卜的DC8和大豆的pGmPM2等屬于第3族LEA蛋白()。,在干旱脫水過(guò)程中細(xì)胞液的離子濃度會(huì)迅速升高。高強(qiáng)度的離子濃度造成細(xì)胞的不可逆?zhèn)?。?族LEA蛋白中的11個(gè)氨基酸殘基組成的基元序列可形成兼性-螺旋結(jié)構(gòu),提供一個(gè)具疏水

34、區(qū)的親水表面。螺旋的疏水面可形成同型二聚體。處在親水表面的帶電基團(tuán)可整合細(xì)胞脫水過(guò)程中濃縮的離子。如Na+和PO3-4。此外,組成該蛋白的大多數(shù)氨基酸殘基為堿性。 這些高電荷的氨基酸殘基可以重新定向細(xì)胞內(nèi)的水分,束縛鹽離子、從而避免干旱脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)高濃度離子的累積所引起的損傷、同時(shí)也可防止組織過(guò)度脫水。,目前,在多種植物中都有關(guān)于第3族LEA蛋白或基因的研究報(bào)道。有人認(rèn)為這些基因的表達(dá)或蛋白累積與植物的滲透脅迫抗性正相關(guān)。 例如,在嚴(yán)重干旱的小麥幼苗中,第3族LEA蛋白累積量的大小與組織的耐旱能力密切相關(guān)。 此外。脫水還可造成Lea mRNA,包括第3族Lea mRNA轉(zhuǎn)錄水平的增加。在所有已

35、知的第3族LEA蛋白中,對(duì)大麥的第3族LEA蛋白HVAl的研究較多。HVAl基因在開(kāi)花后25天,開(kāi)始在種子糊粉層和胚中高水平表達(dá)、而在淀粉質(zhì)的胚乳細(xì)胞中卻檢測(cè)不到HVAl mRNA及相關(guān)蛋白。但可被干旱等環(huán)境脅迫和ABA誘導(dǎo)表達(dá)。如萌芽3天的大麥幼苗經(jīng)0.l mmolL-1 ABA或干旱處理后,幼苗的所有器官中均有高水平的HVAl mRNA和蛋白質(zhì)出現(xiàn)。 Duan等(1996)將HVA1 cDNA全序列導(dǎo)入水稻,獲得了抗旱、抗鹽的轉(zhuǎn)基因水稻,直接證實(shí)了第3族LEA基因可能具有干旱保護(hù)功能。 但也有相反報(bào)道,如從耐脫水更蘇植物Craterostigma plantagineunz分離出一個(gè)第3族

36、LEA基因PcC3-06,將其轉(zhuǎn)到煙草中高效表達(dá)。但轉(zhuǎn)基因煙草在抗旱性方面并沒(méi)有得到提高。 因此對(duì)于第3族LEA蛋白的詳細(xì)功能及其在細(xì)胞中的生理作用還有待進(jìn)一步的深入研究。,（4） 第4族LEA蛋白,棉花lea 14、D113和更蘇植物Craterostigma PGC2745P屬于第4族LEA蛋白, N端氨基酸序列形成兼性螺旋,C端序列保守性較差,呈無(wú)規(guī)則結(jié)構(gòu)，在膜結(jié)構(gòu)中可能形成一種保護(hù)結(jié)構(gòu),或起束縛離子的作用,植物脫水時(shí)可保持膜穩(wěn)定性,以代替水的作用。,（5） 第5族LEA蛋白,第5族D29 LEA蛋白,也含有重復(fù)的11個(gè)氨基酸序列,與3族D7的序列相比,每個(gè)氨基酸化學(xué)性質(zhì)相似,只是每個(gè)殘

37、基位置缺乏高度專一性,這一族蛋白在植物缺水期間有富集離子的作用。 LEA蛋白是一類(lèi)親水性大家族,盡管分為不同的族,但它們有共同的特點(diǎn),都是由極性氨基酸組成,是親水性的多肽,甘氨酸含量6%, 親水指數(shù)1.03,具有高度的親水性。 LEA蛋白除了在干旱脅迫中發(fā)揮作用之外,寒冷、鹽脅迫也同樣誘導(dǎo)LEA基因表達(dá)及LEA蛋白積累。 如將番茄lea25基因?qū)脶劸平湍改芴岣咂淇购芰?。小球藻的C27品系在冷鍛煉過(guò)程中產(chǎn)生的低溫誘導(dǎo)蛋白HiC6。該蛋白與甘藍(lán)型油菜的第3族LEA蛋白lea76具同源性。這些研究表明,LEA蛋白在植物耐寒、耐鹽性方面也發(fā)揮重要作用。,（二）LEA蛋白的功能與抗旱性,LEA蛋白最

38、大的物理化學(xué)特性是具有很高的親水性和熱穩(wěn)定性,即使在煮沸條件下也能保持水溶狀態(tài)。研究表明,植物在水分脅迫時(shí)面臨的最主要問(wèn)題是細(xì)胞組成成分的晶體化,這將破壞細(xì)胞的有序結(jié)構(gòu)。而LEA蛋白具有高度的親水性,能把足夠的水分捕獲到細(xì)胞內(nèi),從而保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫的傷害。 LEA蛋白的另一個(gè)特點(diǎn)是,它們中的有些成員可被ABA和水分脅迫因子誘導(dǎo)產(chǎn)生, 有時(shí)二者的作用可相互代替。如未發(fā)育成熟的小麥胚在體外培養(yǎng)時(shí)并不累積LEA蛋白,但若在培養(yǎng)基中加入ABA或施加滲透脅迫條件,則可誘導(dǎo)LEA蛋白的產(chǎn)生。 植物嚴(yán)重脫水受害是由于水分損失導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)凝結(jié),受到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)傷害之故,而LEA蛋白則能夠削弱這種傷害。在干旱

39、環(huán)境下,多數(shù)植物能誘導(dǎo)LEA蛋白,但LEA蛋白的抗旱機(jī)制仍然不清楚。,Swire和Marcotle(1999)用酵母菌試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng),研究小麥第1族LEA蛋白中Em蛋白功能,認(rèn)為該蛋白在酵母中對(duì)細(xì)胞膜有滲透保護(hù)作用,在正常滲透濃度下,酵母細(xì)胞Em蛋白的表達(dá)對(duì)生長(zhǎng)無(wú)害,但在高滲透濃度下,能夠抑制或減慢生長(zhǎng),促進(jìn)各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。由于第1族LEA蛋白含有大量極性氨基酸和無(wú)序(無(wú)盤(pán)旋)結(jié)構(gòu), 它能吸附大量束縛水,因而對(duì)胚乳和植物生長(zhǎng)組織的滲透脅迫有保護(hù)作用,這是用酵母表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)結(jié)構(gòu)功能研究第1族LEA蛋白對(duì)滲透保護(hù)機(jī)制的第一個(gè)生化證據(jù)。 Zhang(2000)等用酵母異質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)研究水分脅迫下

40、LEA蛋白對(duì)細(xì)胞代謝的作用,他們先向該系統(tǒng)轉(zhuǎn)入兩個(gè)lea基因,即番茄lea4(2族)和大麥HVAl(3族),在GALl啟動(dòng)子的作用下進(jìn)行表達(dá),用特異抗病毒檢測(cè)這些基因產(chǎn)物。結(jié)杲發(fā)現(xiàn):當(dāng)轉(zhuǎn)入1.2molL-1 NaCl介質(zhì)時(shí),HVAl基因在酵母細(xì)胞中提前表達(dá),但不促進(jìn)基因的表達(dá);當(dāng)轉(zhuǎn)入1.2 molL-1KCl介質(zhì)時(shí), lea4和HVAl基因在細(xì)胞中均表達(dá),以致生長(zhǎng)減慢;在高山梨糖醇介質(zhì)中,這兩種基因沒(méi)有明顯變化。若細(xì)胞含有這兩個(gè)lea基因,抗凍性就會(huì)增加,而抗熱性則無(wú)變化,說(shuō)明LEA蛋白對(duì)保護(hù)細(xì)胞質(zhì)脫水有著特殊作用。盡管人們對(duì)LEA蛋白作了大量研究,但迄今有關(guān)各族LEA蛋白的確切功能還不清楚,

41、只能根據(jù)其氨基酸序列和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷。,(三)LEA蛋白序列結(jié)構(gòu)與其抗旱性,根據(jù)LEA蛋白序列結(jié)構(gòu)特殊性,Baker(1988)等提出一種假設(shè),認(rèn)為D29 LEA蛋白(也存在于D7LEA中)含有由11個(gè)氨基酸組成的重復(fù)基元序列,即T/A、A/T、O/E、A/T、A/T、K/R、Q/ED、K/R、A/T、X、ED/Q,此種序列形成的氨基酸鹽橋,可充實(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),提高細(xì)胞液中的離子強(qiáng)度,從而抵抗或減輕干旱引起的傷害。這類(lèi)重復(fù)元件多數(shù)存在于-螺旋結(jié)構(gòu)中,疏水和親水氨基酸位于此螺旋中的特定部位,在其分子內(nèi)部可能形成維管束,表層有結(jié)合陰陽(yáng)離子的功能。,LEA蛋白有較高親水性,不僅有序列特異性,

42、空間結(jié)構(gòu)也有特點(diǎn)。在水分缺乏時(shí),此種蛋白在細(xì)胞中像可溶性糖的作用一樣,有增強(qiáng)束縛水的作用。 Baker等(1988)報(bào)道,缺水條件下,D13和D11 LEA蛋白能“溶解”在細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)中,其結(jié)構(gòu)的卷曲部分,能形成適應(yīng)其他結(jié)構(gòu)的形狀,此結(jié)構(gòu)與水產(chǎn)生的結(jié)合力比糖形成的穩(wěn)定性強(qiáng),至少在晶體保護(hù)上比蔗糖好。McCubbin和Kay(1985)發(fā)現(xiàn)小麥Em蛋白(D19)親水性比多數(shù)球蛋白多肽強(qiáng),在生理?xiàng)l件下, 70%以上肽鏈處于無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài),植物缺水時(shí),這些特殊結(jié)構(gòu)有束縛水分子的作用。盡管D13 LEA蛋白在長(zhǎng)螺旋結(jié)構(gòu)N端無(wú)親水性,但在無(wú)規(guī)則卷曲的尾部則有較強(qiáng)束水作用。,三、水孔蛋白與植物抗旱性,所謂

43、水通道即存在于哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞膜及微生物中轉(zhuǎn)運(yùn)水的特異孔道, 該孔道是由一系列具有同源性的內(nèi)在膜蛋白家族成員所形成,稱為水通道蛋白或水孔蛋白(aquaporin, AQP)。 植物水孔蛋白在植物體內(nèi)形成水選擇性運(yùn)輸通道,在植物種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔運(yùn)動(dòng)、受精等過(guò)程中調(diào)節(jié)水分的快速跨膜運(yùn)輸。 有些水孔蛋白還在植物逆境應(yīng)答中起著重要作用,因此研究水孔蛋白與植物抗旱性的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。,（一）植物水孔蛋白的發(fā)現(xiàn),水是生命之源,細(xì)胞內(nèi)外水分平衡的穩(wěn)定是維持生命的關(guān)鍵因素之一。但水通過(guò)細(xì)胞膜的機(jī)制一直是個(gè)謎,所有組織細(xì)胞膜都允許水以簡(jiǎn)單擴(kuò)散的方式通過(guò), 后來(lái)注意到動(dòng)植物的一些器官、組織具有獨(dú)特的

44、水分運(yùn)轉(zhuǎn)能力,例如動(dòng)物的紅細(xì)胞和腎上皮細(xì)胞,它們運(yùn)輸水分的速度非?？?人的腎臟細(xì)胞平均每晝夜要過(guò)濾180L的水,動(dòng)物的腎小球集合小管在抗利尿激素的作用下,對(duì)水的通透性可在幾秒鐘內(nèi)發(fā)生從低到高的急劇變化;植物在種子萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)時(shí)伴隨著由體積增大而發(fā)生的水分快速吸收,這些都不能以水穿越膜脂質(zhì)雙分子層彌散來(lái)解釋,故形成了在某些組織中可能存在功能性水通道的假說(shuō)。 Macey(1984)第一個(gè)證明了對(duì)氯汞苯磺酸(p-chloromercuribenzene sulfonete, PCMBS)對(duì)紅細(xì)胞膜水通透性具有強(qiáng)烈抑制作用。進(jìn)一步研究證明, PCMBS對(duì)尿素的通透性無(wú)影響。這種水通道與溶質(zhì)通道明顯

45、相互獨(dú)立的狀態(tài)表明,有水選擇性通道蛋白的存在。,1988年Agre等在鑒定人類(lèi)Rb血型抗原時(shí),偶然在紅細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)了一種新的跨膜蛋白。此種蛋白既可以以非糖基化的28kDa多肽的形式存在,也可以是一條遷移至4060kDa的N-糖基化帶,兩者的比例大約為3:1。氨基酸測(cè)序發(fā)現(xiàn)28kDa蛋白和眼晶狀體主體內(nèi)在蛋白MIP26是同系物,因此有了暫用名“CHIP”(channel-like integral membrane protein)。19911992年,Agre及其同事又先后完成了該蛋白的分子克隆和功能鑒定,證實(shí)該蛋白具有水通道功能,從而確認(rèn)了細(xì)胞膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)水的水通道蛋白的理論。1997年被基

46、因組命名委員會(huì)重命名為AQPl。 AQPl的發(fā)現(xiàn),掀起了人們分離、鑒定水孔蛋白(亦稱水通道蛋白)的高潮。短短幾年內(nèi),人們巳在細(xì)菌、酵母、動(dòng)物、植物中分離出許多水孔蛋白同源基因。在植物中第一個(gè)水孔蛋白r-TIP是由Maure等(1993)從擬南芥中分離出來(lái)的。r-TIP的cRNA在爪贍卵母細(xì)胞中的異源表達(dá),證明它具有水分運(yùn)輸特性,屬于植物水孔蛋白中的液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast-membrane intrinsic protein,TIP)。植物質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic protein, PIP)也是在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)的, Kammerloher等(

47、1994)用擬南芥根質(zhì)膜內(nèi)在總蛋白產(chǎn)生的多克隆抗血清來(lái)免疫篩選擬南芥根cDNA文庫(kù)，得到了幾個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)鑒定為植物質(zhì)膜水孔蛋白。,水孔蛋白與1984年Gorin等從牛晶體纖維(bovine lens fiber)細(xì)胞膜中分離到的跨膜通道主嵌入蛋白(major intrinsic protein, MlP)基因具有很高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性,因此將它們同歸于MIP家族,分子質(zhì)量在2629kDa之間, 在生物膜中形成水通道并協(xié)助水分跨膜運(yùn)輸?shù)哪?nèi)在蛋白。絕大多數(shù)水孔蛋白形成水的選擇性通道,但也有一些水孔蛋白同時(shí)也可運(yùn)輸小分子中性親水溶質(zhì)。,（二）植物水孔蛋白的種類(lèi),植物水孔蛋白根據(jù)序列同源性可

48、以分為三類(lèi): PIP (質(zhì)膜內(nèi)在蛋白) TIP(液泡膜內(nèi)在蛋白) NLM蛋白(nodulin 26 like MIPs, NLM)。,PIP主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜上,Kammerlober等(1994)以擬南芥質(zhì)膜內(nèi)蛋白的抗體為探針,運(yùn)用哺乳動(dòng)物眼細(xì)胞表達(dá)體系,從擬南芥的cDNA文庫(kù)中篩選了5個(gè)MD相關(guān)蛋白。它們普遍存在于根、莖、葉及果實(shí)質(zhì)膜上,因此稱為PIP, PIP可再分為PIP1, PIP2和PIP3三類(lèi)。 Robinson等(1996)運(yùn)用免疫定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)擬南芥葉肉細(xì)胞質(zhì)膜上PD1主要聚集在一種被稱為質(zhì)膜體(plasmalemmassome)特殊結(jié)構(gòu)域,在這些區(qū)域質(zhì)膜和液泡膜彼此接觸,從而

49、加快了液泡與質(zhì)外體之間的水分交換。 PIP與TIP之間的氨基酸同源性較低(約50%左右),而且PIP較TIP具有較長(zhǎng)的N端。在PIP中,PIP1和PIP2的區(qū)別在于N端和C端的不同, PIP1比PIP2具有較長(zhǎng)的N端和較短的C端,而且在序列當(dāng)中各有相應(yīng)的保守氨基酸。Daniels等(1994)發(fā)現(xiàn)原先鑒別的干旱脅迫蛋白R(shí)D28也具有水通道活性, RD28與PIP2b具有高度同源性,它們的氨基酸序列及cDNA序列有92%同源性。,TIP (tonoplast intrinsic protein)主要分布在細(xì)胞液泡膜上。TIP可再分為、-TIP等4類(lèi),它們的cDNA在爪贍卵細(xì)胞中異源表達(dá)時(shí),未發(fā)現(xiàn)

50、它們運(yùn)輸水分以外的小分子。Hofte等(1992)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥不同細(xì)胞的液泡膜存在著兩種不同的TIP：-TIP和-TIP。-TIP主要存在于種子液泡膜上,-TIP則位于除種子以外的所有營(yíng)養(yǎng)體器官的液泡膜上,-TIP和-TlP之間的氨基酸序列有58%同源性。-TIP、-TIP與菜豆種子液泡膜上TIP的同源性分別為68%和58%。運(yùn)用Gus融合基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)-TIP在不同植物組織中表達(dá)模式很不一樣,其表達(dá)僅局限于頂端分生組織后很窄的區(qū)帶,亦即TIP表達(dá)與細(xì)胞液泡化同步。TIP的分子質(zhì)量比PIP和NLM的分子質(zhì)量小,而且等電點(diǎn)分析表明,TIP的酸性比PIP和NLM的酸性大,這主要是由于PIP和NLM

51、的C端區(qū)域的堿性較強(qiáng)。,NLM蛋白中除了NOD26(nodulin26)已知分布在細(xì)菌與植物的共生膜上外,其他成員在細(xì)胞中的定位未知。NOD26是植物中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的MIP家族成員,它由271個(gè)氨基酸殘基組成,負(fù)責(zé)植物細(xì)胞與細(xì)菌之間小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。Roberts等(1997)發(fā)現(xiàn)爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的NOD26具有汞敏感的水通道活性,除運(yùn)輸水分以外,對(duì)甘油、甲酰胺等不帶電的溶質(zhì)分子也具有較高的通透性。NLM在分子質(zhì)量與等電點(diǎn)上同PIP較為相似,但對(duì)其成員了解較少。,（三）植物水孔蛋白的結(jié)構(gòu),水孔蛋白的結(jié)構(gòu)都具有MIP家族結(jié)構(gòu)的典型特征。HgCl2 對(duì)水孔蛋白功能的抑制發(fā)生在Cys殘基上,且往往與

52、NPA保守序列相鄰的Cys。在CHIP28中, Hg+的抑制位點(diǎn)是Cys189,但Cys189對(duì)CHIP28的功能并不是必需的,它僅是Hg+敏感位點(diǎn)。這巳從存在Hg+不敏感型水孔蛋白得到證實(shí),如植物質(zhì)膜上的水孔蛋白R(shí)D28就是Hg+不敏感型的,它的NPA序列附近沒(méi)有cys殘基。Walz等證明,雖然CHIP28單體可形成獨(dú)立的水通道,但其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能的正確行使,則需要蛋白在膜上的四級(jí)組裝。膜冰凍蝕刻(freeze-fracture)技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn),4個(gè)CHIP28亞單位組成一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。,AQP1的每個(gè)亞單位共跨膜6次,并在胞內(nèi)外形成5個(gè)環(huán)(A、B、C、D、E)。A、C、E環(huán)位于胞外,B、D環(huán)

53、及氨基和羥基末端位于胞內(nèi)。,AQP1一個(gè)亞單位的“沙漏”模型,A,B,C,D,E,值得注意的是Jung等(1994)提出的“沙漏”模型(the hourglass model,圖)?！吧陈蹦Ｐ驮诒３炙椎鞍變蓚€(gè)重復(fù)單元對(duì)稱性的前提下,依據(jù)B和E環(huán)都為典型的疏水結(jié)構(gòu),使兩環(huán)分別從膜兩側(cè)埋入膜內(nèi)。通過(guò)分子的折疊, B和E環(huán)形成一狹窄的水孔道。CHIP28中汞敏感位點(diǎn),即E環(huán)的Cys189和可能存在于B環(huán)的Cys73就位于水孔道的上下方。 然而,結(jié)構(gòu)上的分析尚不能說(shuō)明水孔蛋白的選擇性。Macey(1984)推算水通道的直徑應(yīng)大于1.5A(水分子直徑)、小于2.0A(最小可通透溶質(zhì),如尿素的直徑)。

54、盡管“沙漏”模型中分子折疊形成的孔道,可以從孔徑大小上說(shuō)明尿素不能通過(guò)水孔蛋白,但是還無(wú)法反映水孔蛋白不選擇離子或H3O+這一特性。,(四）植物水孔蛋白的存在部位,在植物細(xì)胞內(nèi),水孔蛋白主要分布在原生質(zhì)膜和液泡形成體(tonoplast,即液泡膜)。 水孔蛋白的表達(dá)具有時(shí)空特異性,在有水分大量流動(dòng)的組織和器官中水孔蛋白的表達(dá)很高,如根表皮、外皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞、靠近木質(zhì)部導(dǎo)管的木薄壁細(xì)胞、韌皮部伴胞、保衛(wèi)細(xì)胞以及在植物發(fā)育的特定階段,如種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、花粉管伸長(zhǎng)、維管形成等時(shí)期,某些水孔蛋白的表達(dá)異常豐富。 例如:擬南芥-TIP在種子儲(chǔ)藏囊泡中特異表達(dá); NOD26只在大豆根瘤中細(xì)菌與植物共

55、生膜中表達(dá);煙草的TobRB7在根柱中表達(dá);而煙草的NtAQP1在根中靠近維管組織的細(xì)胞表達(dá);向日葵的Sun TIP-7和SunTIP-20均在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá); 冰草的MIP-A在根的分生組織及木薄壁細(xì)胞中表達(dá);擬南芥的PIPb和-TIP、玉米的TIP及油菜的BobTIP26-1、Bn-TlP等均有報(bào)道表明它們參與細(xì)胞的伸長(zhǎng)與分化。水分是在水勢(shì)梯度的驅(qū)動(dòng)下由水孔蛋白被動(dòng)運(yùn)輸?shù)?植物通過(guò)改變水孔蛋白的豐度或水孔蛋白的狀態(tài)來(lái)控制水的流入或流出。,（五）植物水孔蛋白的功能,1、在種子成熟和萌發(fā)過(guò)程中的作用,種子儲(chǔ)藏薄壁細(xì)胞的液泡具有許多特定功能,并與蛋白儲(chǔ)藏、裂解、運(yùn)輸以及代謝相適應(yīng)。而水孔蛋白TI

56、P在種子成熟過(guò)程中大量積累,故認(rèn)為其在種子成熟與萌發(fā)中起著重要的作用。在種子成熟過(guò)程中大量的儲(chǔ)藏蛋白合成,種子內(nèi)形成了數(shù)以萬(wàn)計(jì)的蛋白儲(chǔ)藏囊泡(PSVs)。在種子萌發(fā)過(guò)程中,種子迅速吸水,液泡膜的流動(dòng)性增強(qiáng),伴隨著蛋白儲(chǔ)藏囊泡中的儲(chǔ)藏物質(zhì)分解,溶質(zhì)從儲(chǔ)藏囊泡中釋放出來(lái),后期液泡又融合形成大的中央細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)滲透系統(tǒng)劇變,種子需要迅速進(jìn)行的新的滲透平衡。TIP的存在使水快速出入液泡以保證細(xì)胞能迅速膨脹和緊縮。Johnson和Hofte(1990)等研究表明,TIP在種子成熟晚期積累,在種子萌發(fā)及幼苗初期消失,取代它的是另外一種水孔蛋白TIP,與幼苗初期細(xì)胞的伸長(zhǎng)有關(guān)。,2、在水分運(yùn)輸過(guò)程中的作用,

57、AQP對(duì)水既有專一性，負(fù)責(zé)水分的跨膜快速流動(dòng)，具有嚴(yán)格的選擇性。經(jīng)HgCl2處理后可抑制水分透性90%以上。 Netting等(2000)發(fā)現(xiàn),水分是目前發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)唯一中性小分子; AQP的跨膜通道內(nèi)側(cè)分布著疏水氨基酸殘基,賦予AQP水分運(yùn)輸高效性,AQP對(duì)水分的選擇是由于跨膜通道直徑僅有3 A , 這就限制了其他物質(zhì)的透過(guò);在跨膜通道內(nèi)部NPA的基序中,Asn76, Asn192兩個(gè)殘基向內(nèi)部突出,因而通道收縮,當(dāng)水分以單分子鏈穿過(guò)通道時(shí),這兩個(gè)殘基與水分子間形成氫鍵,于是水分子之間的氫鍵被打斷,從而形成一道排斥離子而僅允許中性溶質(zhì)通過(guò)的高度非介質(zhì)屏障,此時(shí)質(zhì)子不能被傳遞。,在植物中,水分的

58、長(zhǎng)途縱向運(yùn)輸主要在韌皮部篩管和木質(zhì)部導(dǎo)管(或管胞)中進(jìn)行。在根系,內(nèi)皮層細(xì)胞壁上的凱氏帶對(duì)水分運(yùn)輸形成障礙,意味著在根的皮層或內(nèi)皮層,質(zhì)外體水分流動(dòng)必須進(jìn)入共質(zhì)體,在擬南芥中,PIP1水孔蛋白在根內(nèi)皮層中的表達(dá)高于在根皮層中的表達(dá)證實(shí)了這一點(diǎn)。木質(zhì)部薄壁細(xì)胞也是水孔蛋白高度表達(dá)的地方,在控制水分的滲透和水壓運(yùn)動(dòng)過(guò)程中起著重要的作用。 Steudle和Boyer(1985)提出,水從木質(zhì)部流出的速度由導(dǎo)管周?chē)男〖?xì)胞決定。由此可以設(shè)想,維管束細(xì)胞中-TIP的表達(dá)和RD28的誘導(dǎo)應(yīng)比其他細(xì)胞高。Ludevid等(1992)用報(bào)告基因研究啟動(dòng)子證實(shí)了-TIP在維管束中的表達(dá)高于薄壁組織及皮層細(xì)胞。,3、在植物滲透調(diào)節(jié)中的作用,許多植物細(xì)胞具有高度的液泡膜水分滲透性。液泡膜上的水孔蛋白可減少對(duì)跨細(xì)胞水分運(yùn)輸?shù)囊号葑枇Α?Kiyosawa和Tasawa(1977)發(fā)現(xiàn)輪藻細(xì)胞的液泡膜對(duì)水通透性比質(zhì)膜更高;在煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和洋蔥表皮細(xì)胞中,液泡膜的滲透性為原生質(zhì)膜滲透比的100倍。表明水孔蛋白在液泡膜的水分運(yùn)輸方面具有滲透調(diào)節(jié)作用。,在成熟細(xì)胞中,原