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文檔簡介

1、第9節(jié)DNA的一次結(jié)構(gòu)測(cè)定和化學(xué)合成、一、DNA一次結(jié)構(gòu)測(cè)定(DNA sequencing )、DNA的一次結(jié)構(gòu)：聚脫氧核苷酸鏈中脫氧核苷酸的序列堿基序列、DNA堿基序列測(cè)定的主要方法，1975年，Sanger加減法1977年DNase抑制：可加入檸檬酸鈉、EDTA等金屬螯合劑或添加去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS )； 或者加入蛋白質(zhì)變性劑。 RNase抑制：實(shí)驗(yàn)器的高溫，或者不能高壓滅菌、高壓滅菌的用0.1%二乙基吡咯碳酸鹽(diethyl pyrocarbonate，DEPC )處理。 增強(qiáng)的蛋白改性劑，如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。 加入核糖核酸酶抑制蛋白(RNasin )等RNase抑制劑。

2、 二、DNA的提取、改變鹽濃度的提?。?mol/L NaCl溶解DNP、0.14mol/LNaCl沉淀DNP、酚振動(dòng)提取除去蛋白質(zhì)、沉淀DNA (乙醇、異丙醇)蛋白酶k和SDS消化后， 酚提取去除蛋白質(zhì)真核細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)與核蛋白質(zhì)(DNP )結(jié)合，RNA和蛋白質(zhì)與RNP結(jié)合，利用DNP和RNP在不同濃度NaCl中的溶解度差異可以分離DNP和RNP。DNP相對(duì)溶解度、NaCl(mol/L )、分離沉淀DNA、三、RNA的提取、RNA不穩(wěn)定，同時(shí)RNase隨處可見，使RNA分離困難。 無RNase環(huán)境的總RNA提取：酸性胍鹽(異硫氰酸胍) /酚/氯仿提取mRNA提?。?oligo dT，4，核酸含量的測(cè)定，核酸是由磷酸、戊糖、堿組成的核苷酸的聚合物。 因?yàn)槿咭缘确肿訑?shù)存在，所以只要測(cè)定三者的任意成分的含量就可以推定核酸的含量。 一般的核酸測(cè)定方法是紫外吸收法、定磷法、定糖法RNA的定量測(cè)定、地衣酚法DNA的定量測(cè)定、二苯胺法、分光光度修正、比色杯、DNA或RNA的定量、A260=1.0是相當(dāng)于： 50g/ml雙鏈DNA的A260/A280 DNA A280=1.8 RNA純品： A260/A280=2.0電泳

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