1、沉默NET-1基因 對肝癌細胞生物學行為的影響,陳莉，王桂蘭，秦婧，吳園園，朱建偉 南通大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科 南通大學醫(yī)學院病理學教研室,肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma HCC）是全球性的健康問題之一。我們南通啟東是WHO確定的HCC高發(fā)研究現場。 研究基于我們的首次發(fā)現NET-1在HCC組織中特定表達，并發(fā)現該基因參與HCC細胞的分裂增殖和癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的細胞運動過程,探討針對NET-1的siRNA抑制肝癌癌細胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表達，及該基因對癌細胞增殖、遷移、內吞的影響。,一、項目研究背景,NET-1與NET-2到NET-7一

2、起統(tǒng)稱為NET-X，它們是由Serru等于2000年在EST 數據庫中發(fā)現的7 個新的含4 次跨膜蛋白超家族( transmembrane 4 superfamily 或tetraspan family, 簡稱TM4SF) 的成員。,NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1) 定位于染色體1p34.1上，其mRNA全長為1297bp(基因庫登記號碼AF065388)，為TM4SF的成員之一，最近證實其為腫瘤相關基因。,1、NET-1siRNA表達質粒和myc-NET-1重組表達質粒的構建 。 2、細胞培養(yǎng)與轉染。 3、細胞內總RNA抽提及RT-QPCR檢測NET-1m RNA。 4、W

3、estern blot檢測NET-1蛋白表達。 5、CCK-8法檢測細胞增殖活性。 6、流式細胞儀(FCN)檢測各組細胞處于不同細胞周期中的比例與增殖指數。 7、細胞劃痕試驗檢測細胞二圍空間的遷移能力。 8、Transwell小室檢測細胞三圍空間的遷移能力。 9、Capture-ELISA方法測量細胞內生物素標記的轉鐵蛋白水平。 10、 anti-uPAR標記的癌細胞偽足形成實驗。,一、 材料與方法,系統(tǒng) 組織 成人組織 胎兒組織 惡性組織 第一組 第二組 第三組 消化系統(tǒng) 胃 + NA* + 食道 + NA NA 小腸 + NA NA 結腸 + NA NA 直腸 + NA + 胰腺 NA +

4、 肝 + 泌尿生殖系統(tǒng) 腎 + + + 睪丸 + + + 宮頸 + NA (halan 細胞l) + 宮體 + NA + 前列腺 + NA NA 乳腺 + NA NA 內分泌系統(tǒng) 垂體 + NA NA 甲狀腺 + NA NA 腎上腺 + NA NA 淋巴造血系統(tǒng) 造血細胞 NA * 淋巴結 + NA NA 骨髓 NA NA 脾臟 + NA NA 胸腺 + NA NA 神經系統(tǒng) 腦 + + NA 脊髓 + NA NA 視網膜 + NA NA 其他 心 + 黑色素瘤 + 肺 + + NA 肌肉 + + NA 皮膚 + + NA 胎盤 + NA NA *NA:現在未做檢測； *白血病，淋巴瘤,1.

5、檢測人體組織中NET-1mRNA表達 鎖定研究目標 HCC,二、結果,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11,Lanes M: 200ng of 1kb size ladder (New England BioLabs); Lanes1-3: Normal Fetal Liver Tissues; Lanes 4-7: Normal Adult Liver Tissues; Lanes 8 -11: Liver Cancer Tissues,轉染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721細胞中NET-1mRNA的表達（RT-QPCR） 以未處理組為1。NET-1-

6、siRNA組和myc-NET-1組分別與未處理組相比 (P0.05，p0.01)； NET-1-siRNA組與pU6H1-GFP組相比(P0.05，p0.01)；myc-NET-1組與pcDNA3.1/myc組相比( P0.05，p0.01),2、RT-QPCR檢測轉染NET-1siRNA和myc-NET-1細胞中NET-1 mRNA的結果,3. NET-1蛋白表達在HCC組織中顯著高于癌旁組織中。,-actin,NET-1,Lanes 1,3,5,7 cancerous tissues; Lanes2,4,6,8: adjacent noncancerous tissues,（1）隨時間的延

7、長NET-1-siRNA處理組細胞增殖明顯減少； NET-1穩(wěn)定表達組細胞增殖明顯增多。,4. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞增殖,（2）NET-1-siRNA處理組細胞存在G0/G1和G2/M期阻滯，G0/G1和G2/M期細胞比例分別增加了17.04%和10.97%，S期細胞比例降低。NET-1穩(wěn)定表達組細胞更快地進入細胞周期進程，G0/G1期細胞比例明顯降低。,GFPsiRNA組,NET-1 siRNA組,對照組,NET-1過表達組,5. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞遷移,在NET-1siRNA組中顯著減少(p0.05） NET-1 siRNA處理細胞后遷移能力明顯下降。,轉染4

8、8h后穿過Matrigel膠細胞數NET-1 siRNA組（21.425.74）和pU6H1-GFP（45.608.25）差異有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05）；myc-NET-1組（64.806.14）和pcDNA3.1/myc（38.207.22）差異有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05）。,6. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞內吞,轉鐵蛋白(Tfn)內吞實驗顯示，NET-1 siRNA組癌細胞的內吞能力明顯下降。其他組間的內吞作用變化不明顯 。,未處理 anti-NET-1 兔IgG NET-1siRNA GFP-siRNA,7. 干擾NET-1 可以抑制HCC細胞侵襲偽足形成,NET-1siR

9、NA處理細胞偽足形成細胞百分比明顯減少(p0.01),NET-1siRNA處理細胞中以anti-uPAR標記的癌細胞偽足明顯減少。,8.干擾NET-1 可以抑制裸鼠HCC的生長,myc-NET-1,NET -1 siRNA,9.NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后的研究,(1) NET-1表達與HCC臨床病理因素密切相關。,NET-1基因蛋白表達與HCC臨床病理因素的關系(76例),（2）Kaplan-Meier生存曲線,（3）Cox比例風險模型多因素生存分析,HCC轉移、組織學分級，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表達均具有獨立的預后意義。 風險分

10、析提示這些因素增強時均能增加HCC病人的死亡風險(其風險比均1),三、討論,本文通過構建NET-1siRNA和myc-NET-1表達質粒，并轉染肝癌細胞SMMC-7721。研究發(fā)現NET-1基因參與肝癌細胞的增殖分裂活動，干擾肝癌細胞NET-1基因的表達，可以抑制癌細胞的增殖，使細胞生長受限，可以抑制細胞在二圍、三圍空間的遷移能力、癌細胞內吞能力和侵襲性偽足形成能力。相反，增加NET-1基因的表達，癌細胞表現為顯著增生，更快地進入細胞周期，遷移能力提高。研究結果揭示了肝癌細胞中NET-1基因的功能，為肝癌的發(fā)生、發(fā)展機制增添了新的內容。 NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后相關性的研究顯示

11、為NET-1表達與HCC的組織學分型、病理分級、脈管轉移等臨床病理因素密切相關。癌中NET-1高表達患者生存期明顯減少、 NET-1高表達具有獨立的預后意義。 NET-1 高表達能增加HCC病人的死亡風險。,1.首次發(fā)現NET-1在肝臟良惡性組織中表達的特點。 2.在HCC細胞中干擾NET-1表達，抑制癌細胞的遷移、 侵襲、內吞和偽足形成的能力，并能抑制裸鼠HCC 生長。提示NET-1可能在HCC細胞運動中發(fā)揮作用， 是HCC細胞增殖相關蛋白。 3.NET-1表達與HCC臨床病理因素密切相關，是顯著影響患者預后的獨立指標，高表達患者死亡風險增加，具有顯著的臨床預后評估價值。 4.已研制的NET-1多克隆抗體，可用于免疫組化、蛋白 印跡等多種實驗，具有臨床