1、第二章分子克隆工具酶，1，限制性核酸內(nèi)切酶是識(shí)別雙鏈DNA分子中某些特定核苷酸序列(48bp)以切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。1 .定義，第一節(jié)限制核酸內(nèi)切酶(Restriction endonuclease)，2 .來(lái)源，3 .性質(zhì)，原核生物，內(nèi)切酶，4。功能、自我保護(hù)作用、細(xì)菌限制和修飾系統(tǒng)、(1)限制(Restriction)、細(xì)菌本身的DNA堿基受甲基化修飾，不能被自身限制內(nèi)體酶切割。(2)受精(Modification)，2，限制性內(nèi)切酶的類(lèi)型，I型限制性內(nèi)切酶目前正在鑒定三種茄子其他類(lèi)型的限制性內(nèi)切酶。類(lèi)II限制性內(nèi)切酶，類(lèi)III限制性內(nèi)切酶首先從M. Meselson和R. Yua

2、n牙齒1968年大腸桿菌B股和K股分離出來(lái)。(1)酶結(jié)構(gòu)，1。I型限制性內(nèi)切酶(1%)(例如EcoB和EcoK)。基于三亞市的雙功能酶：R:限制酶亞基M3360甲基化酶亞基S:識(shí)別DNA序列亞基，需要ATP，Mg2，SAM(S-腺苷蛋氨酸)牙齒。(3)作用機(jī)制，切割部位識(shí)別部位1000 BP以外的非特異性，Recognize site，cut，1-1.5kb，(2)切割部位，首先H.O .II限制性內(nèi)切酶(93%)、(1)酶結(jié)構(gòu)、相反方向組合的同系物二聚體內(nèi)切酶和甲基化酶分離、(2)識(shí)別序列、DNA雙鏈的回文對(duì)稱(chēng)序列(旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列、反向重復(fù)序列)通常與長(zhǎng)DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。在ecor I: 5-

3、gaat TC-3 3-CT AAG-5，(3)切割部分和識(shí)別部分切割雙股DNA。形成“粘性末端”(sticky end)或“平整末端”(blunt end)。例如，(4)“粘性末端”(sticky ends，cohensive ends)，多個(gè)核苷酸單鏈的末端。EcoR I觸點(diǎn)等5端凸出、gaat TC、CTT aa g、g aa TTC、CTT AAG、5-、-3、3-、-等茄子類(lèi)型，平成平面末端，擠出的3個(gè)末端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶(如AAA或TTT等)添加多個(gè)多核苷酸尾部，以形成人工粘性末端。5端標(biāo)記，突出的5端可以用DNA核苷酸激酶做32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)充平成平端。識(shí)

4、別相同序列的限制內(nèi)切酶稱(chēng)為智人。(5) Isoschizomers，同治酶(完全同立酶):識(shí)別部位和觸點(diǎn)完全相同。Hind、Hsu I等。hind 5-AAG CTT-3 3-TTC GAA-5 hsu I 5-AAG CTT-3 3-TTC GAA-5，標(biāo)識(shí)站點(diǎn)相同，但觸點(diǎn)不同。例如Xma I和Sma I。同軸節(jié)酶(不完全同立酶):識(shí)別出的序列不同，但可以切割同一粘性末端的酶。bamh I、Bgl、Bcl I、Xho等，(6)同工酶(isocaudamers)，5-gg ATCC-3 3-cc標(biāo)記-5，BamH I，bbe Y，5-gatc - 3 3 - ctag-5，sau 3ai，同一

5、尾酶的粘性末端徐璐結(jié)合形成的新部位一般不能被原酶識(shí)別。、5-G3-cctag、gatct-3a-5、bamh I、bgl、5-gg atct-3-cc taga-5、bamh I、(8)s型限制性內(nèi)切酶(5%)，轉(zhuǎn)移切割：gacgcnnnnn，HGA I，ctgcgnnnnnnnnnnn，5，3.gagc TC CTT AAG GAC GTC ctatag ACC tagg。(10)針對(duì)網(wǎng)站偏好、限制酶、不同位置的相同識(shí)別序列徐璐顯示不同的切割效率。這稱(chēng)為網(wǎng)站偏好。(11)提供酶促反應(yīng)條件、緩沖：MgCl2、NaCl/KCl: Mg2和離子強(qiáng)度Tris-HCl: ph保持；雙氧水糖醇(DTT)

6、:維持酶的穩(wěn)定性。牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定反應(yīng)溫度。大部分37反應(yīng)時(shí)間：一般1h，很多酶反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶楊怡減少。終止酶的方法：A，10mM/LEDTA b，加熱，大部分酶為65溫?zé)崛?，可以長(zhǎng)生5分鐘。c，苯酚萃取蛋白，和乙醇沉淀DNA。(12)星號(hào)(*)活動(dòng)，在極端鄭智薰標(biāo)準(zhǔn)條件下，可以截?cái)嗯c限制酶識(shí)別序列類(lèi)似的序列。牙齒變化的特殊性稱(chēng)為星號(hào)活性。3 .III類(lèi)限制內(nèi)切酶(1%)、物語(yǔ)雙功能酶、在剪切點(diǎn)下游24-26bp的反應(yīng)需要ATP、Mg2、SAM(S-腺苷蛋氨酸)牙齒。很少用于基因工程操作。4 .貴胃內(nèi)切酶、內(nèi)含子編碼的內(nèi)切酶以及一些蛋白質(zhì)剪切產(chǎn)物(內(nèi)含肽)也有內(nèi)切酶活性，

7、這種內(nèi)切酶稱(chēng)為貴胃內(nèi)切酶。1973年H.O Smith和D. Nathans建議的命名方案如下：3，限制性內(nèi)切酶的命名，1。名字的第一個(gè)字和宗名的前兩個(gè)字組成三個(gè)字的縮略語(yǔ)，表示寄主真菌的宗名。Escherichia coli顯示為Eco。流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)用Hin標(biāo)記。4 .限制酶前面要帶R(Restriction)，公式酶前面要帶M(Modification)。(現(xiàn)在省略)。2 .右下標(biāo)的大寫(xiě)字母，表示菌株或類(lèi)型。Ecok，EcoR(現(xiàn)在都是平行寫(xiě)的，像EcoRI。)，3 .如果特殊的寄主菌有多種茄子限制和恢復(fù)系統(tǒng)，就用羅馬字表示。EcoR I、E

8、coR V等。DNA中的雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等)都影響酶的活性。1 .DNA的純度，4，影響限制性內(nèi)切酶活性的因素，純化DNA增加酶的使用增加保溫時(shí)間，擴(kuò)大反應(yīng)量(20l)，一般大腸桿菌一般是兩種茄子甲基化酶修飾質(zhì)粒，2。DNA甲基化程度，有dam甲基化酶(修飾GATC中)，Dcm甲基化酶(修飾CCA/TGG中的C)。甲基化酶失活突變菌株應(yīng)在基因工程內(nèi)使用。不同限制性內(nèi)切酶的最佳反應(yīng)溫度不同。大部分是37度，少數(shù)要求40-65度。溫度是影響限制酶活性的重要因素。4 .緩沖(Buffer)、(1)緩沖液的化學(xué)成分、MgCl2、NaCl/KCl: Mg2和離子強(qiáng)度。T

9、ris-HCl:保留ph；雙氧水糖醇(DTT):維持酶的穩(wěn)定性。牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定性。商業(yè)化限制酶通常有專(zhuān)用緩沖液。5，限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化，1。內(nèi)切酶和識(shí)別序列的結(jié)合模式，通過(guò)1986年J.A. McClarin等X-張藝興晶體，發(fā)現(xiàn)II類(lèi)限制酶(II)以同型二聚體的形式與靶序列相結(jié)合。GAATTC、CTTAAG、DNA中內(nèi)切酶的所有識(shí)別點(diǎn)都被截?cái)嗔恕? .完全消化，1，2，3，4，3 .部分消化，10毫米(2，3，4，1，4，4)。限制酶酶反應(yīng)的結(jié)束，(1)處理65 80至20分鐘，酶活性大部分喪失，(3)可以用苯酚提取去除蛋白質(zhì)，乙醇沉淀DNA (4)是試劑盒純化

10、DNA，6。限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的交叉列表，1。限制性核酸內(nèi)切酶2，限制性內(nèi)切酶類(lèi)型I型限制內(nèi)切酶II型限制內(nèi)切酶III型限制內(nèi)切酶III型限制內(nèi)切酶3，限制性內(nèi)切酶命名4，影響限制性內(nèi)切酶活性的因素5，限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA的消化，第二節(jié)甲基化酶，1。功能：保護(hù)宿主DNA免受相應(yīng)限制酶切割的大腸桿菌中，大部分具有以下部位的特異甲基化酶。2 .甲基化酶種類(lèi)，Dam甲基化酶GATC，A-N6甲基化腺嘌呤BAMH3360GG ATCDCM甲基化酶CCAGG，CCTGG，C-5甲基胞嘧啶ECOR: CCWGG，1/8kb甲基化酶識(shí)別位點(diǎn)減少，識(shí)別Sss，3 .甲基化對(duì)限制酶切割的影響應(yīng)在基因工程中使用

11、甲基化酶停用突變菌株。如果限制性內(nèi)切酶的識(shí)別點(diǎn)與表達(dá)Dam或Dcm甲基化酶的菌株分離，甲基化識(shí)別點(diǎn)與內(nèi)切酶識(shí)別點(diǎn)重疊，則限制性內(nèi)切酶的部分或全部酶可能不會(huì)被切斷。修改后的酶切部位，產(chǎn)生新的酶切部位，對(duì)基因組映射的影響，第3節(jié)DNA聚合酶，1，基因工程中常用的DNA聚合酶，大腸桿菌DNA聚合酶2。Klenow fragment 3。T4噬菌體DNA聚合酶4。T7噬菌體DNA聚合酶5，2。主要區(qū)別在于T7 DNA聚合酶不會(huì)從模板上脫落，可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs。其他幾個(gè)茄子DNA聚合酶如果連續(xù)添加10個(gè)以上的dNTPs，就會(huì)從模板中分離出來(lái)。第二，常用DNA聚合酶的特征是持續(xù)合成能力和外周酶活性不同。3，DNA聚合酶的基因工程用途，1 .大腸桿菌DNA聚合酶I，(1)大腸桿菌DNA聚合酶I的性質(zhì)，單鏈多肽。53 exo酶活性位于n末端。用枯草桿菌蛋白酶處理，可以切掉N端的53外切酶活性部分。成為Klenow fragment。53 DNA聚合酶活性。53激肽釋放酶活性，基質(zhì)：dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，Mg2，具有探測(cè)玻璃末端的引物，DNA模板，(2)DNA聚合酶I(，)(威廉莎士比亞，DNA，DNA，DNA，DNA，DNA，DN