1、基因工程,專題1,煙草,據(jù)WTO調(diào)查：2004年全世界因狂犬病致死人數(shù)約5.5萬人 中國(guó)衛(wèi)生部通報(bào)：2004年月，狂犬病列法定報(bào)告?zhèn)魅静∷劳鰯?shù)之首。發(fā)病死亡率近100%,能產(chǎn)生狂犬病抗體蛋白的轉(zhuǎn)基因,每100kg 豬或牛的胰腺中僅可提取45g。,1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。,治療糖尿病特效藥,據(jù)WTO調(diào)查： 2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬。,胰島素,思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀 在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？,密碼子在生物界是的！,通用,抗蟲害的玉米,轉(zhuǎn)基

2、因鮭魚,基因工程產(chǎn)品,轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒,乳汁中含有人生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷),基因工程的概念,基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),生物體外,基因,DNA分子水平,剪切拼接導(dǎo)入表達(dá),人類需要的基因產(chǎn)物,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,早期基礎(chǔ)理論,達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,早期基礎(chǔ)理論,孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,早期基礎(chǔ)理

3、論,摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,克里克等提出中心法則,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,后期基礎(chǔ)理論,1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，19

4、66年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。,基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) 2)工具酶的發(fā)現(xiàn) 3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明 4) DNA體外重組的實(shí)現(xiàn) 5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功 6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世 7)PCR技術(shù)的發(fā)明,基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程,DNA是遺傳物質(zhì)的證明 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立 遺傳密碼的破譯 基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) 工具酶的發(fā)明 DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明 DNA體外重組的實(shí)現(xiàn) 重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功 第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問世 PCR技術(shù)的發(fā)明,問題探討：,蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。 讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花

5、細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。 想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？,普通棉花抗蟲棉,基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：,在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？,普通棉花(無抗蟲特性),蘇云金芽孢桿菌,提取,抗蟲基因,通過運(yùn)載體導(dǎo)入,轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因,轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體,轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性,一、DNA重組技術(shù)的基本工具,基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：,關(guān)鍵步驟一：,抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來,關(guān)鍵步驟二：,抗蟲基因與棉花DNA“縫合”,關(guān)鍵步驟三：,抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞,一、DNA重組技術(shù)的基本工具,解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？,“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,“分

6、子縫合針” DNA連接酶,“分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,一、DNA重組技術(shù)的基本工具,DNA重組技術(shù)的基本工具,限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀” DNA連接酶“分子縫合針” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體“分子運(yùn)輸車”,思考：,自然界是否存在一種生物的DNA進(jìn)入另一生物的情況？ 動(dòng)物容易讓外來DNA侵入自身而得以遺傳嗎？ 為什么？植物呢？ 原核生物，容易遭到入侵嗎？ 原核生物并沒有在進(jìn)化中滅絕，而是產(chǎn)生了一些特殊的酶來防范。這些酶應(yīng)該有什么特點(diǎn)？,可能酶能識(shí)別外來侵入的DNA并將其分解，而對(duì)自身的DNA不能起作用。,“分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶,主要來源：原核生物,限制酶在原核生物中的作用

7、,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。 含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。,限制酶的種類與命名：,現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。,EcoR,Sma,粘質(zhì)沙雷氏桿菌 （Serratia

8、marcesens）,大腸桿菌 （Escherichia coli R）,練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株( Haemophilus influenzae d ) 中先后分離到3種限制酶，則分 別命名為:,Hind、Hind和Hind,限制酶的作用特點(diǎn),作用特點(diǎn)：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開 切點(diǎn)：磷酸二酯鍵 舉例：EcoRI限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開,限制酶的識(shí)別序列：,限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn),限制酶所識(shí)別的序列，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是

9、反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。,限制酶切割的結(jié)果,限制酶,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端平末端,黏性末端和平末端,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？,要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,思考?,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,EcoR,將不同種來源的DNA片段連接起來,生物A基因片段,生物B基因片段,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,酶切,

10、二、“分子縫合針” DNA連接酶,作用:,把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.,作用原理：,催化磷酸二酯鍵形成,DNA連接酶“分子縫合針”,連接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為Ecoli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T4連接酶。 這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而不能連接單鏈DNA。 Ecoli連接酶只能連接黏性末端； T4連接酶既可“縫合”黏性末端，又可“縫合”平末端。,可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，,Ecoli DNA連接酶 或T4DNA連接酶,即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵,T4 DN

11、A連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低,T4DNA連接酶,比較：,EcoliDNA連接酶,T4DNA連接酶,來源,功能,大腸桿菌,T4噬菌體,恢復(fù) 磷酸 二酯鍵,只能連接黏性末端,能連接黏性末端和平末端(效率較低),相同點(diǎn),差別,（二）“分子縫合針”DNA連接酶,尋根問底,DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?,1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵,形成磷酸二酯鍵,1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵,2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈,2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板,三、“分子運(yùn)輸

12、車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,思考：,假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？,作為分子運(yùn)輸車載體，如果沒有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？,霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來做分子運(yùn)輸車嗎？,目的基因有沒有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？,基因的載體“分子運(yùn)輸車”,載體必須具備的條件： 1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存； 2、具有1-多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接； 3、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等 ） 4、對(duì)受體細(xì)胞無害,載體的作用： 1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。 2、利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對(duì)外源基因進(jìn)行大

13、量復(fù)制。,常用的載體有： 質(zhì)粒，噬菌體的衍生物，動(dòng)植物病毒等,質(zhì)粒,質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體，它廣泛地存在于細(xì)菌中，是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細(xì)菌擬核DNA的百分之一。,要對(duì)天然質(zhì)粒進(jìn)行人工改造,以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析： GC AATTC GC CTTAA CG G CG G,(1)其中和 是由一種限制酶切割形成的 末端，兩者要重組成一個(gè)DNA 分子，所用DNA連接酶通常是 。 （2） 和 是由另一種限制酶切割形成的 末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常是 。,反饋練習(xí)：,達(dá)標(biāo)練習(xí),在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同種限制酶 B. 兩種限制酶 同種連接酶 D. 兩