1、酶的高通量篩選和定向篩選報(bào)告員：黃劍宇導(dǎo)師：枚衛(wèi)，生物催化劑介紹，生物催化劑和轉(zhuǎn)化是以細(xì)胞或酶為催化劑進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化，大批量生產(chǎn)化學(xué)物質(zhì)、醫(yī)藥、能量、材料的科學(xué)。 優(yōu)點(diǎn)：一種生物催化劑能催化一系列基質(zhì)或許多非天然基質(zhì)的酶具有高選擇性，特別是具有化學(xué)催化劑無(wú)法模仿立體和區(qū)域選擇的優(yōu)勢(shì)的生物催化反應(yīng)，通常反應(yīng)條件溫和，環(huán)保。 缺點(diǎn)：目的介質(zhì)中生物催化劑的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的活性下降或完全喪失生物催化劑可以催化我們所知的各種反應(yīng)，但對(duì)特定的基質(zhì)和產(chǎn)物可選擇的酶通常很少，而且目前只有極少數(shù)的酶可商業(yè)獲得。 從酶的發(fā)現(xiàn)到生產(chǎn)應(yīng)用通常是一個(gè)困難的漫長(zhǎng)過(guò)程。 實(shí)際應(yīng)用取決于與傳統(tǒng)工業(yè)過(guò)程的競(jìng)爭(zhēng)，只有在競(jìng)爭(zhēng)中取得明顯

2、的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，生產(chǎn)應(yīng)用、生物催化研究過(guò)程、酶的篩選、酶的篩選分為選擇培養(yǎng)基篩選法和檢測(cè)培養(yǎng)基篩選法。 選擇培養(yǎng)基的篩選法通過(guò)添加或減少某種成分使目標(biāo)菌株得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但其他菌株的生長(zhǎng)受到抑制，通過(guò)多次篩選分離最終得到目標(biāo)菌株。 單碳源的選擇性培養(yǎng)基，可以利用反應(yīng)基質(zhì)的微生物得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)而大量繁殖，不能利用反應(yīng)基質(zhì)的微生物由于得不到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)而受到抑制，得不到所需的目標(biāo)菌株。 互補(bǔ)方法是篩選在有營(yíng)養(yǎng)缺陷的培養(yǎng)基中可合成該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的菌株。 培養(yǎng)基篩選法通常通過(guò)在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，培養(yǎng)后引起培養(yǎng)基的透明度的變化或菌落周?chē)伾淖兓饶撤N可識(shí)別的變化，從而區(qū)別不同種類(lèi)或生理特性的微生物。 這

3、種篩選可以用檢測(cè)平板進(jìn)行，也可以用細(xì)孔滴定板進(jìn)行，可以容易地用一部分檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)高通量的篩選。 采用酶的高通量篩選比色法和熒光檢測(cè)的高通量篩選、檢測(cè)培養(yǎng)基篩選法，顯色基團(tuán)或熒光基團(tuán)參與基質(zhì)的催化反應(yīng)最易實(shí)現(xiàn)高通量篩選。 通過(guò)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中顏色和熒光的變化，可以有效地監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行。 通過(guò)使用比色校正和熒光校正檢測(cè)顯色和熒光基質(zhì)，pH指示劑的顯色反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移也能夠以高吞吐量實(shí)時(shí)檢測(cè)。 基于比色法和熒光測(cè)定的高通量篩選顯色或熒光基質(zhì)的高通量篩選，大部分熒光和顯色基質(zhì)都具有高酸度的苯酚或苯胺脫除基，目前廣泛應(yīng)用的是以硝基苯和蘑菇衍生物為基質(zhì)的該技術(shù)檢測(cè)但是，這樣的基質(zhì)通常不穩(wěn)定，反應(yīng)特異性差

4、，反應(yīng)速度快，比普通的基質(zhì)高幾位數(shù)，不適用于難以轉(zhuǎn)化就難以合成的反應(yīng)和粗酶催化劑的反應(yīng)以及一些條件激烈的反應(yīng)，例如高溫、高pH值等。 在比色法和熒光測(cè)定的高通量篩選pH指示劑顯色高通量篩選的基礎(chǔ)上，許多水解反應(yīng)伴有pH的變化，根據(jù)反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)平衡常數(shù)選擇合適的pH指示劑可以準(zhǔn)確測(cè)定水解反應(yīng)速度。 pH指示劑的顯色技術(shù)廣泛應(yīng)用于腈水解酶和酯水解酶等水解酶的篩選Quick E法，根據(jù)pH指示劑的顯色反應(yīng)相互監(jiān)測(cè)對(duì)映體基質(zhì)的水解速度，根據(jù)水解速度的不同評(píng)價(jià)酶的立體選擇性。 該技術(shù)最近用于熒光假單胞菌酯酶定向進(jìn)化中突變體的篩選，得到了立體選擇性明顯提高的突變體。該方法可以擴(kuò)展用于生物多聚體的組成動(dòng)力

5、學(xué)、DNA限制酶切反應(yīng)、DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的脫折疊等研究。 最近該技術(shù)被用于檢測(cè)核糖核酸酶的反應(yīng)活性。 基于反應(yīng)熱力學(xué)變化紅外檢測(cè)的高通量篩選，所有物質(zhì)都可以發(fā)出紅外光，光電面聚焦陣列紅外檢測(cè)器可以靈敏地檢測(cè)反應(yīng)中的熱變化(檢測(cè)波長(zhǎng)范圍3-5m，溫度變化10-100mK )。 發(fā)熱反應(yīng)在紅外成像中表示“熱”點(diǎn)，相反吸熱反應(yīng)表示“冷”點(diǎn)，通過(guò)識(shí)別“熱”點(diǎn)或“冷”點(diǎn)，能夠檢測(cè)反應(yīng)有無(wú)進(jìn)行。 紅外檢測(cè)技術(shù)是一種新的有前途的高通量篩選技術(shù)，不需要添加顯色基和熒光基，避免了比色和熒光檢測(cè)方法的局限，但該技術(shù)尚未定量，只能檢測(cè)催化活性高的酶，酶活性的進(jìn)一步研究必須利用傳統(tǒng)方法，方法本身需要進(jìn)一步的發(fā)展和采用復(fù)

6、雜儀器設(shè)備的高通量篩選、高效液相色譜、質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳也用于檢測(cè)反應(yīng)速度，但作為高通量篩選技術(shù)，這些方法測(cè)試成本高，且一天只檢測(cè)數(shù)百個(gè)樣品方法的使用在一定限制下用放射性同位素標(biāo)記基質(zhì)進(jìn)行脂肪酶篩選可獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該方法敏銳準(zhǔn)確，但由于放射性同位素標(biāo)記基質(zhì)的使用受到限制，不能普及。 以酶的篩選、比色和熒光檢測(cè)為代表的高通量篩選方法得到廣泛應(yīng)用，是目前酶高通量篩選的主要研究和發(fā)展方向。 隨著生物催化劑在精細(xì)化工和醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用，對(duì)手性純化合物的大量需求使手性酶的篩選成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，同時(shí)產(chǎn)品價(jià)值的提高也使許多復(fù)雜儀器設(shè)備進(jìn)行高成本檢測(cè)的方法成為可能，并逐漸獲得許多應(yīng)用。 酶分子的定向進(jìn)

7、化，以上方法從自然界篩選的酶通常不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需要。 主要限制因素有酶對(duì)非天然基質(zhì)的惰性、工業(yè)應(yīng)用環(huán)境中的不穩(wěn)定性和低耐受性、非水環(huán)境中的低活力、對(duì)輔酶的依賴等。 酶分子的定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變等基因改造技術(shù)，改變蛋白質(zhì)序列中的個(gè)別氨基酸殘基，可以改造酶的性質(zhì)及其催化特性，產(chǎn)生符合特定需求的酶，這種蛋白質(zhì)工程技術(shù)又稱為分子進(jìn)化的合理修訂。 用隨機(jī)基因突變或基因重組技術(shù)結(jié)合定向突變體篩選方法的分子進(jìn)化技術(shù)稱為定向進(jìn)化。 該技術(shù)避免了人們研究酶結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系的難題，成功地改善了酶的催化特性，如酶的穩(wěn)定性、基質(zhì)特異性、立體選擇性等酶的催化能力和新的代謝途徑工程。 酶分子的定向進(jìn)化、定向進(jìn)化是由突變體庫(kù)

8、的構(gòu)建、突變體的表達(dá)、表達(dá)后篩選三個(gè)步驟組成的循環(huán)遞歸過(guò)程，(1)需要生成含有大量微量有利突變體的文庫(kù)，(2)突變體可在適當(dāng)?shù)奈⑸?例如大腸桿菌或酵母菌)體內(nèi)進(jìn)行功能表達(dá)酶分子定向進(jìn)化半理性文庫(kù)semi-rational或簡(jiǎn)潔文庫(kù)smart libraries的技術(shù)、構(gòu)建變異體文庫(kù)的方法包括以PCR和同源基因重組(DNA shuffling )為代表的各種基因變異和基因重組技術(shù)。 突變體庫(kù)的多樣性和冗馀性，基于對(duì)酶的結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系的研究，發(fā)展了構(gòu)建半理性庫(kù)或簡(jiǎn)潔庫(kù)的技術(shù)。 隨機(jī)插入/去除技術(shù)半理性外顯子重組技術(shù)合成重組技術(shù)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)置修訂技術(shù)、酶分子定向進(jìn)化(歸納)、定向進(jìn)化不僅是酶分子改造

9、的好工具，也是探索和研究酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)效應(yīng)關(guān)系的好工具。隨著各種基因技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，建立含有大量微量有利突變體的文庫(kù)已不再是技術(shù)難題，目前的主要研究方向是構(gòu)建更有效的突變技術(shù)和更簡(jiǎn)潔的突變體庫(kù)的技術(shù)。 突變體篩選技術(shù)仍然是主要技術(shù)瓶頸，除了繼續(xù)發(fā)展本文介紹的各種結(jié)合酶催化功能的高通量篩選技術(shù)外，還將進(jìn)一步完善結(jié)合各種重組表達(dá)技術(shù)的蛋白篩選技術(shù)和蛋白展示庫(kù)技術(shù)。 特別是篩選沒(méi)有明顯表型的突變體需要更多的研究和重視。 目的基因、基因突變技術(shù)、豐富的變種DNA文庫(kù)、高通量篩選技術(shù)、高效生物催化劑、循環(huán)、生物催化劑的定向進(jìn)化、酶的高通量篩選和定向進(jìn)化、正向突變、高通量篩選技術(shù)、 人們對(duì)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)方式的追

10、求，對(duì)能源和環(huán)境的重視，特別是對(duì)醫(yī)藥和精細(xì)化工產(chǎn)品日益增加的巨大需求，進(jìn)一步推動(dòng)了生物催化劑在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。參考文獻(xiàn)、10 Beisson F、Tiss A、Rivire C、 vergerr : methodsforlipasedetectionandassay : a關(guān)鍵審查. eurjlipid 133-153.acomprehensiveanddetailedreviewaboutalllll licesterhydrolysis11beissonf、第n個(gè)安全v、 vergerr : useofnaturallyfluorescenttriacylglycerolsfr

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