1、基因重組和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第 十 四 章,目 錄,第 一 節(jié)DNA的重組 DNA Recombination,DNA重組,接合作用 (conjugation),轉化作用 (transformation),轉導作用 (transduction),轉 座 (transposition),同源重組 (homologous recombination),位點特異的重組(site-specific recombination),發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱

2、基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。,以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。,一、同源重組,Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟,兩個同源染色體DNA排列整齊 一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體 通過分支移動產生異源雙鏈DNA Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：,片段重組體 （見模型圖左邊產物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側來自同一親本DNA。,拼接重組體（見模

3、型圖右邊產物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側來自不同親本DNA。,Holiday中間體,目 錄,片段重組體,拼接重組體,目 錄,二、細菌的基因轉移與重組,（一）接合作用,當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。,可接合質粒如 F 因子(F factor),質粒 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,（二）轉化作用,通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用 (transformation)。,例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一

4、細菌攝取。,目 錄,（三）轉導作用,當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。,噬菌體的生活史,溶菌生長途徑 (lysis pathway) 溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway),例,目 錄,目 錄,三、位點特異重組 位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合。,例 （一）噬菌體DNA的整合 噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地

5、識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)。,例（二）細菌的特異位點重組,沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變,hix為反向重復序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進行特異位點重組(倒位)。H片段上有兩個啟動子P，其一驅動hin基因表達，另一正向時驅動H2和rH1基因表達，反向(倒位)時H2和rH1不表達。rH1為H1的阻遏蛋白基因。,沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變,例（三）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。,輕鏈的基因片段

6、：,重鏈的基因片段：,重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側均存在保守的重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個，分別產生蛋白質RAG1和RAG2。,V,J,分子內轉酯反應,單鏈切開 轉移核苷酸 修復、連接,免疫球蛋白基因重排過程,目 錄,四、轉座重組,由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。,插入序列(insertion s

7、equences, IS)組成： 二個分離的反向重復(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重復序列 一個轉座酶（transposase)編碼基因,發(fā)生形式： 保守性轉座(conservative transposition) 復制性轉座(duplicative transposition),（一）插入序列轉座,插入序列的復制性轉座,目 錄,轉座子(transposons) 可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。 轉座子組成：反向重復序列 轉座酶編碼基因 抗生素抗性等有用的基因,（二）轉座子轉座,由轉座子介導的轉座,目 錄,第 二 節(jié) 重組DNA技術,DNA Re

8、combination Technique,重組DNA技術的發(fā)展史,年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗 1973年 美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子 1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。 1980年 開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠 1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉,相關概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體 基本原理 重組DNA技術與醫(yī)學的關系,本節(jié)主要內容,一、重組DNA技術相關概念,克隆(clone) 來自同一始祖

9、的相同副本或拷貝的集合。,獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。,（一） DNA克隆,技術水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 細胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮?DNA克隆 應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。,生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、

10、酶工程、細胞工程等,目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）,基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。,（二）工具酶,限制性核酸內切酶 DNA聚合酶 逆轉錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉移酶 Taq DNA聚合酶,重組DNA技術中常用的工具酶,限制性核酸內切酶,定義 限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。,+,Bam H,作用 與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系

11、統(tǒng)，限制外源DNA， 保護自身DNA。,分類 、 （基因工程技術中常用型）,第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫； 第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶,類酶識別序列特點 回文結構(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功異源酶 來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶 有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割

12、DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,（三）目的基因,cDNA (complementary DNA) 基因組DNA (genomic DNA),（四）基因載體,定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。,常用載體 質粒DNA 噬菌體DNA 病毒DNA,克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。 表達載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的

13、載體稱為表達載體。,載體的選擇標準,能自主復制； 具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源DNA。,1. 質粒 (plasmid),特點 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。,目 錄,噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?2. 噬菌體(phage),M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,3. 粘性質粒(cosmid),酵母人工染色體 (yeast

14、artificial chromosome, YAC) 細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）,其他,二、重組DNA技術基本原理,以 質 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程,目 錄,（一）目的基因的獲取,1. 化學合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列 。 2.基因組DNA文庫(genomic DNA library) 3. cDNA文庫(cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR

15、) （見第22章）,* 化學合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列,組織或細胞染色體DNA,基因片斷,克隆載體,重組DNA分子,含重組分子的轉化菌,限制性內切酶,受體菌,基因組DNA文庫 存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合,* 從基因組DNA文庫獲取目的基因,目 錄,目 錄,目 錄,（三）外源基因與載體的連接,1. 粘性末端連接 方式：(1)同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接 配伍末端連接 非配伍末端連接,（二）克隆載體的選擇和構建,Bam H切割反應,T4 DNA連接酶 15C,同一限制酶切位點連接,目 錄,不同限制酶切位點（非配伍末端）

16、的連接,Eco R切割位點,Bg l切割位點,配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。,目 錄,2. 平端連接 適用于：限制性內切酶切割產生的平端 粘端補齊或切平形成的平端,目 錄,3. 同聚物加尾連接 在末端轉移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。,載體DNA,目的基因,限制酶或機械剪切,限制酶,目 錄,4. 人工接頭(linker)連接 由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。,人工接頭及其應用,目 錄,受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài)(compete

17、nt),導入方式 轉化 (transformation) 轉染 (transfection) 感染 (infection),（四）重組DNA導入受體菌,（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標記選擇 (2) 標志補救(marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學方法 如免疫化學方法及酶免檢測分析等,(插入失活法) 抗藥性標記選擇,目 錄,組氨酸缺陷 型大腸桿菌,無組氨酸 的培養(yǎng)基,酵母咪唑甘油磷 酸脫水酶基因,促進組氨酸合成,DNA,重組體,標志補救,目 錄,互補,目 錄, 互補的檢測,目 錄,原位雜交,目 錄,Southern印

18、跡,目 錄,雞的肌球蛋白的克隆和檢出,目 錄,重組DNA技術操作過程可形象歸納為,小 結,重組DNA技術操作的主要步驟,目 錄,表達體系的建立 表達載體的構建 受體細胞的建立 表達產物的分離純化,（六）克隆基因的表達,1. 原核表達體系 （E.coli表達體系最為常用） 標準：選擇標志強啟動子 翻譯調控序列多接頭克隆位點 E.coli表達體系的不足 不宜表達真核基因組DNA 不能加工表達的真核蛋白質 表達的蛋白質常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達大量可溶性蛋白,大鼠胰島素原cDNA 的表達和分泌,目 錄,優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當修飾表達的蛋白質 表達產物分區(qū)域積累 缺點：操作技術難、費時、經濟,轉染 將表達載體導入真核細胞的過程,方法：磷酸鈣轉染 DEAE葡聚糖介導轉染 電穿孔 脂質體轉染 顯微注射,2. 真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動物細胞,表達載體pFASTBACI 的物理圖譜,目 錄,目 錄,（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。,三、重組技術與醫(yī)學的關系,（二）生物制藥,重組DNA醫(yī)藥產品,目 錄,基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。,（三）基因診斷,