1、細胞培養(yǎng)中污染物的預(yù)防與清除,中科院上海生化細胞所 2016，Jan，22-24,（科學(xué)院對我們的要求）, 十八大明確提出要“實施創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展戰(zhàn)略，強調(diào)科技創(chuàng)新是提高社會生產(chǎn)力和綜合國力的戰(zhàn)略支撐，必須擺在國家發(fā)展全局的核心位置”。 我國科技服務(wù)業(yè)已經(jīng)具備一定的發(fā)展基礎(chǔ)，但是與英、美等發(fā)達國家相比，我國的科技服務(wù)業(yè)產(chǎn)值及其占GDP比重較低，2011年度實現(xiàn)科技服務(wù)增加值不足7000億元，占GDP比重約為1.4%。 2014年10月，國務(wù)院印發(fā)關(guān)于加快科技服務(wù)業(yè)發(fā)展的若干意見（國發(fā)201449號），這是國務(wù)院首次對科技服務(wù)業(yè)發(fā)展作出的全面部署。,用創(chuàng)新驅(qū)動科技服務(wù)業(yè)的發(fā)展,（國家對我們的要求）,

2、細胞資源為生物醫(yī)藥基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供支撐和保障,細胞資源保藏和技術(shù)研發(fā),人類遺傳資源庫,基礎(chǔ)研究實驗細胞庫,國家發(fā)展和安全戰(zhàn)略,一， 細胞系是重要的遺傳資源。細胞庫的功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發(fā)能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細胞保藏單位的關(guān)鍵抓手，也是推動細胞庫向科技服務(wù)業(yè)轉(zhuǎn)移重心的必經(jīng)之路。 二， 保證細胞株不受污染是細胞庫保藏能力的關(guān)鍵性標志，也是其他能力提升的基礎(chǔ)。,一， 細胞系是重要的遺傳資源。由細胞庫（Cell Bank）負責保存細胞系。,一， 細胞系是重要的遺傳資源。負責保存細胞系的細胞庫應(yīng)當開發(fā)、承擔更多的功能，提升服務(wù)科技、服務(wù)社會的能力，產(chǎn)生更高的服務(wù)業(yè)產(chǎn)

3、值。,一， 細胞系是重要的遺傳資源。保存細胞系的細胞庫其功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發(fā)能力。這三方面的提升是建設(shè)一流細胞保藏單位的關(guān)鍵抓手。,堅持國際接軌的細胞保藏技術(shù)水平，積極吸引國內(nèi)有知識產(chǎn)權(quán)的細胞系進入細胞庫保藏，逐步形成自己的特色。,堅持用戶至上的服務(wù)態(tài)度，全方位為用戶著想為用戶服務(wù)，積極推動庫內(nèi)細胞資源的利用。,密切關(guān)注國際細胞生物學(xué)發(fā)展前沿，主動與醫(yī)院等單位合作，拓寬細胞資源的種類，為我國細胞生物學(xué)的進一步發(fā)展做好準備。,我們的目標,二，污染是細胞培養(yǎng)的大敵。保證細胞株不受污染是細胞庫保藏能力的關(guān)鍵性標志，也是其他能力提升的基礎(chǔ),1，細菌污染 2，真菌污染 3，支原體

4、污染 4，內(nèi)毒素污染 5，細胞間交叉污染,1，細菌污染。 實驗室中因操作不慎而引起的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了預(yù)防劑量的抗菌素也會產(chǎn)生。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成實驗失敗和細胞株(系)丟失。,2，真菌污染 在細胞培養(yǎng)過程中較為常見，尤其在南方霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易產(chǎn)生。最常見的真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培養(yǎng)細胞

5、受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色小點，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。,3，支原體污染 3.1，支原體污染是目前實驗室中最為常見的污染細胞的原核生物。 因支原體屬于直徑介于0.2左右的最小原核生物，形態(tài)易變，故極易通過濾膜而逃過培養(yǎng)液的過濾除菌步驟。在細胞培養(yǎng)液中，支原體可達到107-108CFU/mL （CFU=Colony Forming Unit，支原體濃度測量單位）而不使培養(yǎng)液混濁及影響細胞生長。多種支原體對細胞不產(chǎn)生任何病變效應(yīng)，使得細胞污染不易被察覺。

6、據(jù)報道，目前世界上有30-50%的細胞株已受支原體污染。但是支原體對干細胞培養(yǎng)的影響甚大，胚胎干細胞受支原體污染形態(tài)、生長速度等均出現(xiàn)改變。 在細胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時候，即應(yīng)懷疑支原體污染。,由于多數(shù)細胞受支原體污染后無明顯變化或略有變化，若不及時處理，將產(chǎn)生交叉污染。另外，支原體會改變宿主細胞的結(jié)構(gòu)和功能等一系列特征，因此盡管很多受支原體污染的細胞其形態(tài)看不出變化，但對其進行進一步分子生物學(xué)分析時，其實驗結(jié)果會不準確。為此建議各實驗室定期對細胞進行支原體檢查。 可污染細胞的支原體種類較多，主要有Mycoplasma orale, M.

7、hyorhinis, M.arginini 和 Acholeplasma laidlawii。目前已發(fā)現(xiàn)的支原體超過100種，這就是單一的檢測方法有時會失敗的原因之一。我們建議至少選擇2種方法來檢測支原體。,3.2，常用支原體檢測方法 3.2.1，肉湯培養(yǎng)基檢測法。醫(yī)藥行業(yè)規(guī)定使用。 3.2.2，間接染色法檢測支原體 用待檢測的細胞培液培養(yǎng)Vero細胞，然后用顯微鏡觀察是否有支原體感染。Vero細胞來源于正常的成年非洲綠猴腎組織，由Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年在日本Chiba大學(xué)分離得到。Vero細胞是非整倍體，可在培養(yǎng)液中無限生長，常用來生產(chǎn)疫苗，檢測支原體和細

8、菌外毒素等。細胞培養(yǎng)液中的支原體可用Hoechst33258或DAPI染色后觀察到。由于支原體含有DNA，染色后在細胞表面，培養(yǎng)基中及培養(yǎng)皿表面呈現(xiàn)出熒光小點。,間接染色法檢測支原體,3.2.2，PCR法檢測支原體 許多支原體檢測方法不僅用時長而且復(fù)雜，有的方法僅限于檢測有限種類的支原體。PCR檢測法靈敏度高，特異性強，只用一天時間即可快速檢測細胞培養(yǎng)液中的支原體，是一種檢測支原體的有效手段。中科院干細胞庫選擇支原體16S rDNA序列為靶序列設(shè)計引物，同時做對照組實驗和干擾實驗以避免假陽性或假陰性結(jié)果，取得了很好的效果。,PCR法檢測支原體,預(yù)防：1.支原體噴霧（品牌：Biochrom )：

9、噴于操作臺和培養(yǎng)箱2.Plasmocin prophylactic （品牌：InvivoGen）：作用濃度為5g/ml作用于常規(guī)的細胞培養(yǎng)基（500 x稀釋） 去除：Plasmocin treatment（品牌：InvivoGen）：作用濃度為25g/ml，作用于感染的培養(yǎng)細胞基兩周（1000 x稀釋）。,3.3，支原體污染的預(yù)防和去除,4.1， 細菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)物的危害：實驗證明，細菌內(nèi)毒素對培養(yǎng)細胞（尤其是ES細胞）的生長及活性具有明顯的抑制作用,且該作用具有一定的時間、劑量依賴性。 4.2，細胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的來源：細胞培養(yǎng)基中的主要天然成份-牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是內(nèi)毒素的潛在來

10、源。我國2000年版中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準中對牛血清提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素，支持細胞增殖檢查等等。對于胚胎干細胞培養(yǎng)，LIF和bFGF是細菌內(nèi)毒素的另一個潛在來源。,4，內(nèi)毒素污染,4.3，細胞培養(yǎng)中內(nèi)毒素的監(jiān)控：為排除血清、LIF和bFGF中內(nèi)毒素的污染，細菌內(nèi)毒素檢測是非常重要的。中國科學(xué)院干細胞庫只使用細菌內(nèi)毒素小于1EU/ml的血清、LIF和bFGF等各種生長因子。 4.4，內(nèi)毒素監(jiān)控是細胞用于臨床治療所必須的。 目前各類臨床級干細胞尚無統(tǒng)一的國際、國內(nèi)標準，這是胚胎干細胞進入實際應(yīng)用階段的最大障礙之一，也

11、是細胞庫水平的一個重要標志。但是在制藥工業(yè)中內(nèi)毒素是必須去除的。因此，中國科學(xué)院干細胞庫強調(diào)高標準嚴要求，把內(nèi)毒素監(jiān)控作為細胞培養(yǎng)的常規(guī)標準。,鱟試劑凝膠半定量法檢測（參考2010年版中國藥典）,4.5，內(nèi)毒素檢測方法,鱟試劑：鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme）和凝固蛋白原（Coagulogen）。在適宜的條件下（溫度，pH值及無干擾物質(zhì)），細菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產(chǎn)生凝集反應(yīng)形成凝膠。凝膠法鱟試劑是根據(jù)反應(yīng)所形成凝膠的程度來檢測樣品內(nèi)內(nèi)毒素的含量。,5，細胞間交叉污染,Hela細胞

12、是第一株源細胞系。1952年建系以來，現(xiàn)在世界上已建有幾千株細胞系，為我們的生物醫(yī)藥事業(yè)提供研究材料。但是隨之而來的細胞間交叉污染以及細胞系錯認現(xiàn)象必須得到重視。,細胞間交叉污染,(International Cell Line Authentication Committee, ICLAC),超過400種細胞系已被鑒定為錯認的細胞系,防止細胞交叉污染 （1）在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，最好做上標記便于辨別。并嚴格按順序進行操作，避免一起進行操作時易發(fā)生混亂。 （2）在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。 （3）所有細

13、胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之，重新復(fù)蘇留種細胞進行培養(yǎng)。,每一株細胞都有獨特的來源。因此，對于有疑問的的細胞株，可進行同工酶或STR(short tandem repeat，短片段重復(fù)序列)檢測進行身份鑒定。STR廣泛存在于人類及哺乳動物的基因組中，具有高度多態(tài)性，它們一般由2-6個堿基構(gòu)成一個核心序列，核心序列串聯(lián)重復(fù)排列，由核心序列重復(fù)數(shù)目的變化產(chǎn)生長度多態(tài)性。對于一個特定的個體，染色體上某個特定位置的重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)是固定的，而對于不同的個體在同一位置處的重復(fù)次數(shù)可能不同，這就構(gòu)成了人群中這些重復(fù)序列的多態(tài)性。由于人類基因組中這種重復(fù)序列非常多，通過對這種多態(tài)