1、免疫組織化學(xué)技術(shù) ,免疫組織化學(xué)技術(shù),基本原理 通過免疫學(xué)中抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，用特異性抗體（單克隆或多克隆）檢測(cè)組織、細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原物質(zhì)，形成抗原 抗體復(fù)合物；此復(fù)合物上帶有事先標(biāo)記的標(biāo)記物，通過與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，如酶底物顯色反應(yīng)可使之呈現(xiàn)某種顏色，從而可檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的抗原，以達(dá)到診斷、鑒別診斷和研究的目的。,組織與細(xì)胞材料的制備 免疫組織化學(xué)方法,組織與細(xì)胞材料的制備,組織石蠟切片制作 組織冰凍切片制作 細(xì)胞爬片制作 細(xì)胞涂片制作,切片的制作,組織的固定 組織石蠟包埋 切片,目的: （1）防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞 的固有形態(tài)。 （2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)

2、、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶 性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。防止組織細(xì)胞的 死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。 （3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，造 成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。 （4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制 片。 （5）防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。 （6）經(jīng)過固定的組織能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便 于辨認(rèn)。,組織材料的固定,固定液的選擇： (1)甲醛固定液：10福爾馬林，10中性福爾馬林，10中 性緩沖福爾馬林 (2)4多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改

3、良Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液：過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液。該固定劑 較適合富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保 存較好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加入2.5%重鉻酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液，對(duì)核內(nèi)抗原的保存效果較好。 (10)PEG液 (11)0.4%對(duì)苯醌 (12)碳二亞酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇類固定劑,固定時(shí)間： 固定時(shí)間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時(shí)間成正比，固定液的穿透力及濃度

4、與固定時(shí)間成反比。,大組織：75乙醇30120min，85乙醇30120min，95醇 2h，95乙醇 2h，95乙醇過夜，無水乙醇30 60min，無水乙醇3060min，無水乙醇60min120min，二甲苯、和各15min（可視觀察結(jié)果而定），石蠟30min石蠟12h，石蠟23h。 小組織：75乙醇30min，85乙醇30min，95乙醇1h、1h、過夜或2h，無水乙醇、和各30min，二甲苯15min、10min、10min（肉眼觀察），石蠟30min，石蠟30min，石蠟12h。,組織石蠟包埋,切 片,載玻片的清潔： 市售載玻片需經(jīng)清潔液泡24h，流水沖洗，系列乙醇浸泡，涼干涂膠，如

5、需開展原位雜交，還需將玻片240烤2h。 切片粘合劑的使用：（1）多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度。（2）APES試劑（3-氨基、丙基三氧基硅烷） 干凈載玻片丙酮5min 用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml+50ml丙酮） 13次純丙酮洗二次干燥玻片用鋁箔包好，室溫或4保存?zhèn)溆谩?（3）鉻礬明膠液：鉻礬0.5g 明膠5g H2O2 1000ml （4）甲醛明膠液：40甲醛2.5ml 明膠0.5g H2O2 100ml,切片： 石蠟切片： (1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)編上號(hào) (6)切片可在4保存數(shù)年

6、 冰凍切片： (1)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)庶糖處理 24h，冰凍切片。 (2)冰凍切片后需涼干后立即固定 (3)冰凍切片固定后-80保存?zhèn)溆?細(xì)胞爬片制作,將處理好的蓋玻片放入接種了細(xì)胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內(nèi)。 待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。,細(xì)胞涂片制作,離心將細(xì)胞收集出來，用預(yù)冷的PBS洗23遍，最后用PBS將細(xì)胞重懸。 吸取3050ul（可根據(jù)細(xì)胞量調(diào)整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。 待稍微風(fēng)干以后加4多聚甲醛溶液覆蓋細(xì)胞，固定24小時(shí)。 在細(xì)胞上加一層甘油放-20保存。,免疫組織化學(xué)方法,熒光標(biāo)記

7、免疫組織化學(xué),酶聯(lián)免疫組織化學(xué),熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué),直接法 間接法,酶聯(lián)免疫組織化學(xué),ABC法 S - P法,免疫組化二步法,二步法免疫組化染色步驟,二甲苯脫蠟，梯度酒精置換二甲苯 PBS沖洗3次，每次3分鐘 根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù) 0.3%過氧化氫甲醇液阻斷20分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 PBS沖洗、浸泡5分鐘，3次 正常山羊血清室溫封閉10分鐘,甩去血清，加入適當(dāng)稀釋的一抗，37孵育60分鐘或4過夜 PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次 滴加多聚螯合物，37孵育30分鐘 PBS沖洗，浸泡5分鐘，3次 新鮮配置酶底物顯色液DAB顯色310分鐘 流水沖洗 蘇木素復(fù)染，

8、脫水，透明，封片。 顯微鏡觀察拍照 IPP軟件分析光密度,抗原修復(fù)方法,真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95，真空負(fù)壓處理10分鐘。待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。,微波輻射抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測(cè)Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行

9、染色。,高壓抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。切片放入抗原修復(fù)液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)14分鐘。待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。,隔水熱抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH0.6）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計(jì)測(cè)其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度后（92）。即開始計(jì)時(shí)，持續(xù)40分鐘。待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)

10、行染色。,電爐加熱抗原修復(fù)法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，當(dāng)達(dá)92后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92時(shí)，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。,胃蛋白酶消化法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。PBS洗3次，1分鐘/次。滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20分鐘左右。PBS沖洗3次，2分鐘/次。后按選擇好的免疫組化該法進(jìn)行染色。,胰蛋白酶消化法：切片脫蠟至水。0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。自來水洗，蒸餾水洗。PBS洗3次，1分鐘/次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20分鐘左右。PBS洗3次，2分鐘/次。后按選好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。,注意事項(xiàng),一、抗體的保存 濃縮抗體：有效期內(nèi)，只需放在 4 冰箱內(nèi)，保存時(shí)間可達(dá)1-3年。 即用型抗體：理論上在4 冰箱內(nèi) 可保存半年左右。 PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般 只可放置1-2個(gè)月。,二、出現(xiàn)假陽性的原因 組織切片質(zhì)量不佳，造成假象，如 刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作 為判斷陽性的依據(jù)。 出血和壞死：紅細(xì)胞的內(nèi)源性過氧 化物酶，壞死細(xì)胞釋放的內(nèi)源性過氧化 物酶均可出現(xiàn)假陽性反