1、序列分析軟件DNAMAN 的使用方法簡介,饒志明 博士/教授 博士生導(dǎo)師 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物中心 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 E-mail: ,DNAMAN 是一種常用的核酸序列分析軟件。由于它功能強(qiáng)大，使用方便，已成為一種普遍使用的DNA 序列分析工具。,打開DNAMAN，可以看到如下界面：,第一欄為主菜單欄。除了幫助菜單外，有十個(gè)常用主菜單， 第二欄為工具欄： 第三欄為瀏覽器欄： 在瀏覽器欄下方的工作區(qū)左側(cè)，可見Channel 工具條，DNAMAN 提供20 個(gè)Channel，點(diǎn)擊Channel 工具條上相應(yīng)的數(shù)字，即可擊活相應(yīng)的Channel。 每個(gè)Channel

2、可以裝入一個(gè)序列。將要分析的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入Channel 中可以節(jié)約存取序列時(shí)間，加快分析速度。,如何使用DNAMAN 分析序列,1將待分析序列裝入Channel 通過File Open 命令打開待分析序列文件，則打開的序列自動裝入默認(rèn)Channel。 通過Sequence/Load Sequence 菜單的子菜單打開文件或?qū)⑦x定的部分序列裝入Channel 。 通過Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打開一個(gè)對話框，通過此對話框可以設(shè)定序列的性質(zhì)（DNA 或蛋白質(zhì)），名稱，要分析的片段等參數(shù)。,2 以不同形式顯

3、示序列,通過Sequence/Display Sequence 命令打開對話框， 根據(jù)不同的需要，可以選擇顯示不同的序列轉(zhuǎn)換形式。 對話框選項(xiàng)說明如下： Sequence &Composition 顯示序列和成分,2 以不同形式顯示序列,Reverse Complement Sequence 顯示待分析序列的反向互補(bǔ)序列 Reverse Sequence 顯示待分析序列的反向序列 Complement Sequence 顯示待分析序列的互補(bǔ)序列 Double Stranded Sequence 顯示待分析序列的雙鏈序列 RNA Sequence 顯示待分析序列的對應(yīng)RNA 序列,3DNA 序列

4、的限制性酶切位點(diǎn)分析,將待分析的序列裝入Channel，點(diǎn)擊要分析的Channel，然后通過Restriction/Analysis 命令打開對話框， 參數(shù)說明如下： Results 分析結(jié)果顯示 其中包括： Show summary（顯示概要） Show sites on sequence（在結(jié)果中顯示酶切位點(diǎn)） Draw restriction map（顯示限制性酶切圖） Draw restriction pattern（顯示限制性酶切模式圖）,3DNA 序列的限制性酶切位點(diǎn)分析,Ignore enzymes with more than（忽略大于某設(shè)定值的酶切位點(diǎn)） Ignore enz

5、ymes with less than（忽略小于某設(shè)定值的酶切位點(diǎn)） Target DNA （目標(biāo)DNA 特性） Circular（環(huán)型DNA）， dam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化） all DNA in Sequence Channel（選擇此項(xiàng)，在Sequence Channel 中的所有序列將被分析，如果選擇了Draw restriction pattern，那么當(dāng)所有的channel 中共有兩條DNA 時(shí)，則只能選擇兩個(gè)酶分析，如果共有三個(gè)以上DNA 時(shí)，則只能用一個(gè)酶分析。）,選擇所需的項(xiàng)目，然后按提示操作點(diǎn)擊按扭，出現(xiàn)下列對話框： 參數(shù)說明如下： En

6、zyme 代表（enzyme data file），點(diǎn)擊旁邊的下拉按鈕，出現(xiàn)兩個(gè)默認(rèn)選項(xiàng)，restrict.enz 和dnamane.enz， 如果添加過自制的酶列表，則附加顯示自制酶列表文件名。 其中restrict.enz 數(shù)據(jù)文件包含180 種限制酶，dnamane.enz 數(shù)據(jù)文件包含2524 種限制酶。 選擇其中一個(gè)數(shù)據(jù)文件，相應(yīng)的酶在左邊的顯示框中列出（按酶名稱字母表順序），鼠標(biāo)雙擊酶名稱，則對應(yīng)的酶被選中，在右邊空白框中列出。,要自制酶切列表，可以從左邊酶列表中雙擊鼠標(biāo)選擇多種酶（例如puc18 multiple cloning sites）， 然后點(diǎn)擊按鈕出現(xiàn)下列對話框： 輸入

7、要保存酶列表的文件名，點(diǎn)擊按鈕即可保存。自制酶列表可以方便分析特定的酶切位點(diǎn)。 Cutter 酶切識別序列長度； End 酶切產(chǎn)生的末端，其中包括， Blunt（平頭末端）， 5Overhang（5突出粘性末端）, 3Overhang(3突出粘性末端)， 系統(tǒng)根據(jù)cutter 和end 的設(shè)定情況,在左邊酶列表中顯示符合條件的酶。最后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。,4DNA 序列比對分析（Dot Matrix Comparision）,要比較兩個(gè)序列，可以使用DNAMAN 提供的序列比對工具Dot Matrix Comparision （點(diǎn)矩陣比較）通過Sequense/Dot matrix compa

8、rision 命令打開比對界面， 點(diǎn)擊對比界面左上角的按鈕，出現(xiàn)下列對話框：,參數(shù)說明如下：,Sequence type 序列類型 Sequence 1 參加比對的第一序列選擇框，框內(nèi)選項(xiàng)說明如下： 如果要比對的序列在Channel 中，點(diǎn)擊下拉箭頭，選擇相應(yīng)的Channel，則被選中的Channel 中的序列作為參加比對的第一序列； 也可以從文件夾中選擇參加比對的序列，在File 選擇框上點(diǎn)擊即可。通過Length 選擇參加比對的序列片段。 Sequence 2 參加比對的第二序列選擇框；選項(xiàng)說明同上 Show Sequence 選擇此項(xiàng)，當(dāng)同源性大于設(shè)定值時(shí)，將顯示同源性；,Annotat

9、ions 是否顯示注釋 Comparision 比對參數(shù)， 其中Window 代表Window size（單位比對長度）， Mismatch 代表Mismatch size（單位比對長度中許可的錯(cuò)配值）要快速比對，需將此項(xiàng)設(shè)為0。 Both stran 代表Both strand（雙鏈比對）選擇此項(xiàng)，是指用Sequence 2 中的序列的正鏈和負(fù)鏈分別和Sequence 1 比較。 Sequence 2 正鏈與Sequence 1 比較結(jié)果用黑色點(diǎn)表示，Sequence 2 負(fù)鏈比對結(jié)果用紅色點(diǎn)表示。,Plot box 點(diǎn)陣圖表顯示參數(shù)， Position（起點(diǎn)坐標(biāo)） Width（寬度值） H

10、eight（高度值） Frame size（邊框線粗度值） Dot size（點(diǎn)粗度值） Gridline（虛線框數(shù)）。 參數(shù)設(shè)定好后，點(diǎn)擊按鈕執(zhí)行操作。,5序列同源性分析,（1）兩序列同源性分析 通過Sequence/Two Sequence Alignment 命令打開對話框，如下所示： 參數(shù)說明如下： Alignment method 比對方法， 通?？蛇xQuick(快速比對)或Smith&Waterman(最佳比對)， 當(dāng)選擇快速比對時(shí)，設(shè)置較小的k-tuple 值，可以提高精確度， 當(dāng)序列較長時(shí)，一般要設(shè)置較大的k-tuple 值。k-tuple 值可選范圍26； 蛋白質(zhì)序列：k-t

11、uple 值可選范圍13。 ,（2）多序列同源性分析,通過打開Sequence/Multiple Sequence Alignment 命令打開對話框， 參數(shù)說明如下： File 從文件中選擇參加比對的序列 Folder 從文件夾中選擇參加比對的序列 Channel 從channel 中選擇參加比對的序列 Dbase 從數(shù)據(jù)庫中選擇參加比對的序列 Remove 清除選擇的序列（鼠標(biāo)點(diǎn)擊左邊顯示框中的序列名選擇） Clear 清除全部序列,點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)方法選擇對話框： 選擇其中一種方法，點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)下列對話框： 如果在前一對話框選擇的是Fast alignment,則在此對話框中選擇Quic

12、k alignment,否則選擇 Dynamic alignment 即可。其它參數(shù)不必改變，點(diǎn)擊對話框中間的使其它參數(shù)取原始默認(rèn)值。 點(diǎn)擊左上角按鈕，可以從彈出的對話框中選擇不同的結(jié)果顯示特性選項(xiàng)。點(diǎn)擊按鈕下的按鈕，出現(xiàn)下列選擇項(xiàng)： 可以通過這些選項(xiàng)，繪制同源關(guān)系圖（例如Tree/homology tree 命令）。 顯示蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（Protein Secondary Structure 命令）， 繪制限制性酶切圖（Restriction Analysis 命令）等。,6.PCR 引物設(shè)計(jì),首先，將目標(biāo)DNA 片段裝入Channel,并激活Channel。 點(diǎn)擊主菜單欄中的Primer

13、主菜單，出現(xiàn)下拉菜單， 點(diǎn)擊Design PCR Primers for DNA 命令，出現(xiàn)下列對話框： 參數(shù)說明如下： Primer locations on target 引物定位 其中包括下列選項(xiàng)： Product size（擴(kuò)增目的片段大小） Sense primer (正向引物選擇區(qū)) Antisense primer(反向引物選擇區(qū)) Primer 引物特性包括Length(引物長度)，Tm 值, GC 含量等參數(shù)； Reject primer 引物過濾（將符合引物過濾條件的引物過濾掉）,包括下列選項(xiàng)： 3dimer(可形成3端自我互補(bǔ)的堿基數(shù)) Hairpin stem(可形成發(fā)

14、卡頸環(huán)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)) PolyN(多聚堿基) 3Uique(3端嚴(yán)格配對堿基數(shù)) All matches(引物互補(bǔ)配對百分?jǐn)?shù)) Consentrations 濃度設(shè)定 Product for hybridyzat PCR 產(chǎn)物用于Southern Blot 探針雜交,7畫質(zhì)粒模式圖,我們常常要用到各種質(zhì)粒圖，無論是制作幻燈片，還是發(fā)表文章，常常需要質(zhì)粒圖。DNAMAN 提供強(qiáng)大的繪質(zhì)粒圖功能，能滿足我們的需要。 通過Restriction/Draw map 命令打開質(zhì)粒繪圖界面： 將鼠標(biāo)移動到圓圈上，等鼠標(biāo)變形成“I”時(shí)，單擊鼠標(biāo)左鍵，出現(xiàn)如下菜單： 菜單說明如下： Position 當(dāng)前位置

15、 Add Site 添加酶切位點(diǎn) Add Element 添加要素 Add Text 添加文字 Insert Fragment 插入片斷 Copy Fragment 復(fù)制片斷 Cut Fragment 剪切片斷 Remove Fragment 清除片斷 Frame Thickness 邊框線粗細(xì)調(diào)節(jié),點(diǎn)擊Add Site 選項(xiàng)，出現(xiàn)對話框： 參數(shù)說明如下： Name 要添加的酶切位點(diǎn)的名稱(例如HindIII) Position 位置（以堿基數(shù)表示） 點(diǎn)擊Add Element 選項(xiàng)，出現(xiàn)如下對話框： 參數(shù)說明如下： Type 要素類型（共有三種類型，鼠標(biāo)點(diǎn)擊即可切換） Color/Patte

16、rn 填充色（共有16 種顏色供選擇） Name 要素名稱 Start /End/Size 要素起點(diǎn)/終點(diǎn)/粗細(xì)度,核酸序列的一般分析流程,1.1 核酸序列的檢索 :80/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析 1.2.1 基于NCBI/Blast軟件的核酸序列同源性分析 /blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的兩兩比較 /gorf/bl2.html 1.2.3 核酸序列

17、的批量聯(lián)網(wǎng)同源性分析(方案),1.3 核酸序列的電子延伸 1.3.1 利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子延伸(方案) 1.3.2 利用Tigem的EST Machine進(jìn)行電子延伸 EST Extractor: http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html | EST Assembly: http:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用THC數(shù)據(jù)庫對核酸序列進(jìn)行電子延伸 http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html,1.4 核酸序列的開放閱讀框架分析 1.4.1基于NCBI/O

18、RF finder的ORF分析 /gorf/gorf.html 1.5 基因的電子表達(dá)譜分析 1.5.1 利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子表達(dá)譜分析（方案） 1.5.2利用Tigem的電子原位雜交服務(wù)器進(jìn)行電子表達(dá)譜分析 http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html,1.6 核酸序列的電子基因定位分析 1.6.1 利用STS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位 /genome/sts/epcr.cgi 1.6.2 利用UniGene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子基因定位（方案）,1

19、.7 cDNA的基因組序列分析 1.7.1 通過從NCBI查詢部分基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組序列的分析(方案) 1.7.2 通過從NCBI查詢?nèi)炕蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組序列的分析 /genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 通過從Sanger Centre查詢基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組序列的分析 http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml,1.8 基因組序列的初步分析 1.8.1 基因組序列的內(nèi)含子/外顯子分析 http:/www.bioscienc

20、/urllists/genefind.htm 1.8.2 基因組序列的啟動子分析 /projects/promoter.html,1.9核酸序列的注冊 1.9.1 EST序列的注冊(方案) 1.9.2 較長或全長cDNA序列的注冊(方案) 1.10待分析序列所對應(yīng)的已知克隆的獲取 ,引 物 設(shè) 計(jì),引物 引物的重要性 引物設(shè)計(jì)的原則 引物與PCR 引物設(shè)計(jì)軟件 如何使用Primer Premier 5.0 引物同源性分析,引物（primers),引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端

21、的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。,3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整個(gè)PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進(jìn)行有效的延伸，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。,引物設(shè)計(jì)原則,引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結(jié)構(gòu) 引物3端 引物5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 引物的保守性與特異性 擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu),引物長度,一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使

22、用較長的引物，但最多不超過50個(gè)核苷酸。,堿基分布的均衡性,同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè) GC含量一般40-60% GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性 GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。,引物Tm值,一般要求：55-65。 計(jì)算： 對于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算 對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。 Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15,引

23、物二級結(jié)構(gòu),引物二聚體 盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3端有有較多堿基互補(bǔ) 發(fā)夾結(jié)構(gòu) 尤其是要避免引物3端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。,引物3端,引物的延伸從3端開始，因此3端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對。,引物5端,引物5端可以有與模板DNA不配對堿基，在5端引入一段非模板依賴性序列。 5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。 5端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。

24、5端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。,引物的內(nèi)部穩(wěn)定性,過去認(rèn)為，引物3端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3端最好為G或C。 現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3端盡可能選用A或T，少用G或C。 僅僅3端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。 如果3端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。,引物的保守性與特異性,保守性：通用引物檢測同一類病原微生物盡可能多的型別 特異性：避免非特異性擴(kuò)增,擴(kuò)增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu),模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，在選擇引物時(shí)，應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。 擴(kuò)增區(qū)域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol 引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30 Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length,引物與PCR,引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L 引物濃度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (單位：L) 退火溫度 最適退火溫度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of prim