1、發(fā)育生物學,第一章 序 言,一、前言 (一) 概念 發(fā)育生物學是一門研究生物體從精子和卵子發(fā)生、受精、發(fā)育、生長到衰老、死亡規(guī)律的科學。 發(fā)展基礎：胚胎學、遺傳學、細胞生物學。 發(fā)展過程：形態(tài) 機理 組織器官 細胞 分子,本課程的主要講授內(nèi)容,序言：發(fā)育生物學中的一些基本原理；發(fā)育生物學中的動物模型；發(fā)育生物學中的現(xiàn)代技術。 胚胎的早期發(fā)育：卵裂、原腸作用、神經(jīng)胚作用。 細胞分化的機制：側重基因表達的調(diào)控對組織器官形成和分化的影響。 果蠅軀體輪廓發(fā)育的分子機制 四肢動物的肢體的發(fā)育 性別決定與生殖細胞,主要參考書,Scott Gilbert編:Developmental Biology，6th

2、 Editions, 2000. Lewis Wolpert主編： Principles of Development，1998. Klaus Kalthoff:Analysis of Biological Development，2nd edition, 2001. Bruce M. Carlson: Human Embryology & Developmental Biology, 2nd Edition,1999.,發(fā)育生物學相關期刊,(二)、發(fā)展歷史 1、后成論(epigenesis)和先成論(preformation)之爭 希臘哲學家Aristotle在公元前第4世紀在對雞胚和一些無

3、脊椎動物胚胎觀察后提出胚胎發(fā)育的兩種假設： Preformation:生物個體的一切組成部分都早就存在于胚胎中，各個部分隨著胚胎的發(fā)育而長大。 Epigenesis: 在胚胎的發(fā)育過程中，各種結構是逐漸形成的。,17世紀，意大利胚胎學家 Marcello Malpighi觀察到的雞胚,17世紀，精原學說的代表人物Nicholas Hartsoeker所想像的精子中的微型人法國科學家Bonnet(1745)提出胚胎發(fā)育套裝論,19世紀30年代末：Mathias Schleiden和Theodor Schwann提出細胞學說。 1840, August Weismann提出了生殖細胞論，認為后代個

4、體是通過精子和卵子繼承親本描述軀體特征的信息；卵子是一個細胞，其分裂產(chǎn)生的細胞可分化出不同組織，從而否定了preformation論。 19世紀對Sea Urchin受精卵的觀察發(fā)現(xiàn)，受精卵含有兩個細胞核，并最終合并為一個細胞核，表明細胞核含有遺傳的物質(zhì)基礎。 19世紀末，染色體的發(fā)現(xiàn)和發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目在發(fā)育中的變化規(guī)律，使孟德爾遺傳定律有了物質(zhì)基礎。,2、細胞學說改變了胚胎發(fā)育和遺傳的概念,3、Mosaic and Regulative Development 19世紀80年代，Weismann提出了mosaic development學說：合子中的大量特殊因子在細胞分裂中不均等分配，導致了不

5、同細胞向不同命運的發(fā)育。,3、Mosaic and Regulative Development(續(xù)) 支持嵌合體學說的實驗證據(jù)：Wilhelm Roux的實驗：,3、Mosaic and Regulative Development(續(xù)) Wilhelm Roux的同事Hans Driesch的下述實驗表明，胚胎具有在局部被排除或受損傷后仍正常發(fā)育的能力，即胚胎發(fā)育是可調(diào)節(jié)的。,4、Discovery of Induction 1924年，Hans Spemann和Hilde mangold的移植實驗表明，胚胎的一種組織可以指導另一種相鄰組織的發(fā)育。,5、遺傳學、分子生物學與發(fā)育生物學的結合

6、,1900年，孟德爾遺傳定律研究遺傳元素在世代間的傳遞。 1909年荷蘭植物學家Wilhelm Johannsen提出基因型和表現(xiàn)型的概念，首次使遺傳學和胚胎發(fā)育學發(fā)生關系。 20世紀40年代證明：DNA是遺傳物質(zhì)，控制蛋白質(zhì)的合成。 20世紀50年代發(fā)現(xiàn)：DNA為雙螺旋結構。 20世紀60年代：三聯(lián)體密碼被破解。 20世紀70年代：DNA重組技術出現(xiàn)。 20世紀80年代：轉基因技術出現(xiàn)。 20世紀90年代：動物克隆技術出現(xiàn)。 世紀之交：HGP。 新的突破：stem cells, proteomics, conditional gene knockout, mutagenesis,二、發(fā)育生物

7、學研究中的主要模式動物 各種模式動物各有優(yōu)點，其研究成果不僅可以揭示特定物種的特點，還有助于動物發(fā)育的一些普遍規(guī)律和機制。 (一) Invertebrate Models,主要優(yōu)點1. 體積小，易于繁 殖；2. 產(chǎn)卵力強；3. 性成熟短；4. 易于遺傳操作： 如誘變；5. 基因組序列已全 部測出 (Science, Mar. 24, 2000)。(120Mb encodes 13,601 proteins),1. Drosophila melanogaster: Insect model,2、Caenorhabditis elegans: Worm model,主要優(yōu)點1. 易于養(yǎng)殖：成蟲 體

8、長1mm，易冷 凍保存；2. 性成熟短：2.5-3 天，兩種成蟲；3. 細胞數(shù)量少，譜 系清楚；4. 易于誘變；5. 基因組序列已全部測出 (Science, Dec. 11, 1998)。(97MB encodes 19,099 proteins.),(二)、Vertebrate Models,1. Xenopus laevis: Amphibian model,主要優(yōu)點1. 性成熟短； 2. 卵體大，易于操 作；3. 抗感染力強，易 于組織移植；,主要優(yōu)點1. 體積小，易于飼 養(yǎng)殖；2. 產(chǎn)卵力強；3. 性成熟短；4. 易于遺傳操作： 如誘變；5. 體外受精和發(fā)育， 易于觀察；6. 基因組

9、序列已全 部測出。,2. Danio rerio (zebrafish),3. Mus musculus (Mouse),4. Gallus gallus (Chicken),三、發(fā)育生物學中的基本概念及規(guī)律,(一)、Five major developmental processes 1. Cell division: Cleavage: 細胞分裂快、沒有細胞生長的間歇期，因而新生細胞的體積比母細胞小。,2. Pattern formation: (1) 軀體軸線的制定,2. Pattern formation: (2) 胚層的形成,3. Morphogenesis 最突出的形態(tài)變化發(fā)生在原

10、腸作用開始之后。,4. Cell dif-ferentiation: 人類胚胎可最后發(fā)育出至少250種不同細胞類型，分化通常是不可逆的。,5. Growth 胚胎在基本的pattern形成之后，其體積會顯著增長，原因在于細胞數(shù)量增加、細胞體積增加、胞外物質(zhì)的積累。不同組織器官的生長速度也各異。,(二)、Cell Behaviour Cell behavior Gene Embryonic development 細胞行為主要包括： Cell state: 指基因活性狀況。 Cell-to-cell signaling: 細胞間信號的傳送、接受、反應。 Cell movement and cel

11、l-shape changes:細胞通過形態(tài)改變及運 動產(chǎn)生的機械動力，導致特殊結構的形成。 Cell proliferation: 軀體不同部位的細胞增生速度不一，可導致 整體結構的改變。 Cell death: 在特定的發(fā)育時期，特定部位的細胞的死亡是形成 正確結構所必需的。,(三)、基因控制細胞行為 是通過控制細胞中的蛋 白質(zhì)的產(chǎn)生而實現(xiàn)的,House-keeping proteins:幾乎存在于所有類型細胞中，通常用于產(chǎn)生能量、在代謝途徑中生成或降解產(chǎn)物，如組蛋白及轉錄或翻譯中所必需的蛋白因子。 Tissue-specific proteins: 存在于特殊類型細胞中，從而賦予細胞特定

12、的活性。如血細胞中的血紅蛋白輸氧、肌肉細胞合成myosin、actin、tropomyosin為收縮提供能量。包括酶、生長因子、受體蛋白、結構分子。 細胞可從多個方面來控制蛋白質(zhì)的合成。,(四)、發(fā)育是漸進式的、細胞命運決定于不同的發(fā)育時間,Fate of cells:指正常發(fā)育情況下細胞將發(fā)育的方向，這種方向可因條件的改變而改變(see next slide)。 Determination:指細胞特性發(fā)生了不可逆的改變，發(fā)育潛力已經(jīng)單一化。 Specification:指一組細胞在中性環(huán)境下離體培養(yǎng)，它們?nèi)园雌湔Ｃ\圖譜發(fā)育。,兩棲動物眼區(qū)細胞的潛能隨發(fā)育時期的不同而改變,原腸胚中眼區(qū)將發(fā)

13、育為眼睛。,將原腸胚中眼區(qū)細胞移植到神經(jīng)胚的軀干區(qū)，它們將按新部位的命運發(fā)育為體節(jié)和脊索。,將神經(jīng)胚中眼區(qū)細胞移植到神經(jīng)胚的軀干區(qū)，它們?nèi)詫l(fā)育為類似于眼的結構。,胚胎發(fā)育早期，細胞的發(fā)育潛力更大！,(五)、誘導作用可使細胞互為不同,擴散性信號分子,跨膜蛋白的直接互作,間隙連接(gap junction),信號傳導特點,傳遞距離有限 并非所有細胞都能對某種信號發(fā)生反應。 不同類型細胞可對同一信號發(fā)生不同反應,e.g., 乙酰膽堿使心肌收縮頻率下降，但促使唾液腺分泌唾液。,Autonomous cell fate non-autonomous cell fate,(六)、Patterning常涉

14、及positional information的翻譯,(六)、Patterning常涉及positional information的翻譯(續(xù)),(七)、間距模式(spacing patterns)可通過側向抑制作用產(chǎn)生,(八)、胞質(zhì)決定成分的區(qū)域化及細胞的不對稱 分裂使細胞具有不同的特性,線蟲的不對稱卵裂產(chǎn)生不同命運的卵裂球,二、傳統(tǒng)的發(fā)育生物學研究技術,染料細胞標記,熒光細胞標記,細 胞 移 植,三、控制發(fā)育的基因的鑒定及其表達和功能檢測方法,基因組時代：人類基因組計劃,DNA序列已經(jīng)告訴了我們什么？,后基因組時代功能基因組時代,空間結構？,胞內(nèi)分布及靶位？,影響器官？,基因類型？,底物？

15、,影響途徑？,(一)、鑒定發(fā)育相關新基因的主要方法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因； 分離時空特異性表達基因的方法； 利用基因序列同源性的克隆法； 利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。,(一)、鑒定發(fā)育相關新基因的主要方法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因； 分離時空特異性表達基因的方法； 利用基因序列同源性的克隆法； 利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,隱性突變； 半顯性突變； 顯性突變,突變體的類型,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,突變類型圖示,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,自然群體中的突

16、變體； 化學誘變劑處理，如亞硝基乙脲乙亞硝基脲 (N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea, ENU)； 外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、轉座子利用等； X射線或 r射線照射,獲得突變體的方法,斑馬魚上ENU化學突變研究的成就(1996),從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,化學誘變法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,隱性突變體的鑒定方法,化學誘變法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,反轉錄病毒插入引起的突變的鑒定,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,Expression o

17、f GFP in virus-infected fish,Transient,germline,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,An example of mutational phenotypes,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,DNA插入誘變法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因,Genetic mapping and chromosomal walking； PCR or Southern hybridization； Candidate cloning； Differential display/subtractive cloning,

18、從突變體克隆基因的方法,(一)、鑒定發(fā)育相關新基因的主要方法,從自然或人工突變體中分離鑒定控制發(fā)育的基因； 分離時空特異性表達基因的方法； 利用基因序列同源性的克隆法； 利用生物大分子間的相互作用克隆新的基因。,分離時空特異性表達基因的方法,獲取特定組織：直接取材或轉基因法取材； 構建cDNA文庫； 從蛋白質(zhì)到基因； Differentiatial hybridization/differential display/subtractive cloning,分離時空特異性表達基因的方法,基因芯片/核酸雜交法,Subtractive cloning,分離時空特異性表達基因的方法,利用基因序列同源

19、性的克隆法,用一個物種的基因直接做探針分離另一個物種的同源基因； 根據(jù)多個物種的蛋白序列分離另一個物種的同源基因； 根據(jù)同一基因家族的不同成員間的保守序列分離新的家族成員；,利用大分子間的相互作用克隆新的基因,鑒定可與蛋白質(zhì)結合的DNA序列 分離靶蛋白質(zhì)，（可采用gel-shift assay) 克隆靶蛋白的表達基因。,利用DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用,分離時空特異性表達基因的方法,利用蛋白質(zhì)之間的相互作用,酵母雙雜交法,(二)、基因表達的檢測,mRNA的檢測 蛋白質(zhì)的檢測 啟動子活性檢測,(二)、基因表達的檢測,mRNA的檢測 蛋白質(zhì)的檢測 啟動子活性檢測,mRNA的檢測,Northern b

20、lot Dot blot RT-PCR DNA Microarray in situ hybridization,Northern雜交的作用：檢測基因的轉錄物的存在及是否發(fā)生了選擇性拼接。,mRNA的檢測,原位雜交(in situ hybridization),利用原位雜交技術研究基因表達的時空譜,mRNA的檢測,(二)、基因表達的檢測,mRNA的檢測 蛋白質(zhì)的檢測 啟動子活性檢測,蛋白質(zhì)的檢測,電泳法 Western blot 抗體染色法,(二)、基因表達的檢測,mRNA的檢測 蛋白質(zhì)的檢測 啟動子活性檢測,啟動子活性檢測法,表達載體的構建：,(三)、基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究,基因敲除法(gene knockout) 異位表達法(ectopic expression) Rescue Antisense RNA Antisense oligos DsRNA interference (RNAi) Antibody blocking Dominant negative receptor mutations Dominant interferring allele,用基因敲除法研究基因的功能,三、基因?qū)Πl(fā)育的影響的功能性研究,基因敲除法(gene knockout) 異位表達法(ectopic expression) Rescue Antisen